检索结果-南通市图书馆

嗜热菌Anaerobaculum hydrogeniformans Pif1解旋酶的表达纯化及活性分析

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

嗜热菌Anaerobaculum hydrogeniformans Pif1解旋酶的表达纯化及...

作者：郭海磊西北农林科技大学

学位级别：硕士

解旋酶是一类依赖能量底物水解沿核酸底物特定方向移动并打开碱基之间氢键的酶。生命体中许多重要生化反应过程的进行常常伴随解旋酶的参与调节。Pif1解旋酶家族是依赖ATP水解供能并沿DNA5’-3’方向解旋的解旋酶,Pif1解旋酶自首次被发... 详细信息

解旋酶是一类依赖能量底物水解沿核酸底物特定方向移动并打开碱基之间氢键的酶。生命体中许多重要生化反应过程的进行常常伴随解旋酶的参与调节。Pif1解旋酶家族是依赖ATP水解供能并沿DNA5’-3’方向解旋的解旋酶,Pif1解旋酶自首次被发现就受到广泛关注,它在端粒、线粒体DNA的复制和冈崎片段的加工成熟过程中扮演重要角色。更为重要的是Pif1解旋酶与撞击端粒酶实验已经在体内体外被验证,从这方面可能开拓一个新途径来抑制肿瘤的端粒酶的活性从而治愈肿瘤。因此Pif1解旋酶的深入研究不仅对研究生物进化更对人类疾病的研究与控制有重大意义。本研究以一种嗜热的厌氧棒菌Anaerobaculum hydrogeniformans DNA解旋酶Pif1（Ana Pif1）为材料,利用蛋白原核表达系统获得高纯度Ana Pif1蛋白,利用stop-flow以及DLS等技术对其解螺旋活性和聚集状态进行分析,以期拓展人们对于原核生物Pif1解旋酶家族的认知,主要获得了以下结果。1)通过对AnaPif1解旋酶表达基因的修饰将其与sumo促溶标签一起重组构建入pET15b载体中,形成重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,经鉴定后得到的表达载体可在表达菌株中BL21（DE3）中大量表达,可溶性良好。2)含有大量目的蛋白的细胞破碎上清液经Ni-NTA亲和层析,Sumo酶切,Heparin柱盐粒子梯度洗脱可得到纯度（95%）极高的目的蛋白。分子量大小为55kDa,等电点6.89。3)AnaPif1最佳解旋条件摸索时针对pH条件、Tris、NaCl、MgCl2和DTT浓度等条件对解旋活力的影响来确定最优条件。最终实验发现除DTT外其余条件对AnaPif1解旋酶活力均有不同程度的影响,在pH为7.0的20mmol/L Tris缓冲液中其解旋时间常数最大（1.2 s-1）,盐离子浓度（Na+和Mg2+）也会强烈影响蛋白活,20mmol/L NaCl、2mmol/L MgCl2其解旋活性最佳。因此最佳的解旋条件为:Tris-HCl（pH 7.0）20 mmol/L、NaCl 20 mmol/L、MgCl2 2 mmol/L4)由于AnaPif1解旋酶是嗜热菌蛋白,它的最佳解旋活力的发挥肯定需要特定的温度调节。在最佳buffer条件（Tris-HCl（pH 7.0）20 mmol/L、NaCl 20 mmol/L、MgCl2 2mmol/L）下设置一系列温度梯度（25-50℃）,发现AnaPif1解旋酶的解旋活力强烈依赖于温度的变化,过高或过低的温度其活性都会受到不同程度的抑制。37℃为其最佳解旋温度此时的反应时间常数可达2.4 s-1。5)在探索AnaPif1解旋酶最佳能量供体时发现该蛋白可利用四种核苷三磷酸水解产生的能量来完成解旋反应,但对每种NTP的利用效率不同,蛋白对于ATP的利用效率最高,解旋反应速率可达到1.4 s-1,解旋比例也达到约50%。相比之下,该酶在利用其它三种核苷三磷酸（GTP/UTP/CTP）时,解旋速率以及幅度都较差。这说明AnaPif1解旋酶可以利用多种核苷三磷酸作为能量供体以完成DNA底物的解旋反应,但是其最佳的能量供体为ATP。6)针对26 nt-17 bp、50 nt-16 bp、26 nt-3G4-17 bp这三种底物的活性实验可以看出AnaPif1解旋酶对于双链DNA和G4-DNA的解旋活性相差不大,不管是从解旋速率（三者均在0.95-1.10 s-1之间）还是解旋比例（三者均在40-50%之间）来讲都非常接近。这就说明AnaPif1解旋酶不像酵母Pif1那样能够被G4-DNA所激活,这一点与细菌Pif1相类似。7)利用DLS技术研究蛋白聚集状态时发现,在最佳解旋溶液条件下AnaPif1解旋酶的蛋白颗粒半径为3.4nm,分子量大小为60kDa,说明在此条件下蛋白以单体形式存在没有发生类似酵母Pif1的二聚状态,与细菌Pif1更类似。

关键词：厌氧棒菌 Pif1家族蛋白表达纯化最佳解旋条件 DNA解旋活性

牛、果蝇DHX36解旋酶的表达纯化及活性比较

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2020年第5期48卷 49-56页

作者：李康郭海磊奚绪光西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

【目的】探索牛和果蝇DHX36解旋酶的表达纯化条件及底物结合活性,为深入研究DEAH-box解旋酶提供理论参考。【方法】以较高等动物牛(Bos taurus)和较低等动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)RNA解旋酶BtDHX36和DmDHX36为研究对象,首先... 详细信息

【目的】探索牛和果蝇DHX36解旋酶的表达纯化条件及底物结合活性,为深入研究DEAH-box解旋酶提供理论参考。【方法】以较高等动物牛(Bos taurus)和较低等动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)RNA解旋酶BtDHX36和DmDHX36为研究对象,首先,构建重组表达载体pET15b-sumo-BtDHX36和pET15b-sumo-DmDHX36,将2种质粒分别转入表达菌株BL21(DE3)中,诱导表达2种目的蛋白,利用Ni-NTA层析柱、HisTrap SP HP柱纯化得到目的蛋白。然后,采用荧光各向异性法(FA)研究溶液和温度条件对2种蛋白底物结合活性的影响,以及二者的底物结合偏好性。最后利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术对2种DHX36的双链底物解旋活性进行比较。【结果】获得了纯度大于95%的全长BtDHX36和DmDHX36蛋白,2种DHX36解旋酶的最佳底物结合条件为:20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、反应温度37℃。在此条件下,2种同源DHX36均可结合多种类型核酸底物(ssRNA、ssDNA、parallel G4、anti-parallel G4),且BtDHX36结合平行结构G4底物(parallel G4)的倾向更明显,DmDHX36无此趋势;2种DHX36解旋酶结合不同长度ssDNA的能力不同,BtDHX36更倾向于结合较长的单链DNA底物,而DmDHX36更倾向于结合较短的单链DNA底物;二者均能高效解旋dsRNA和dsDNA底物,DmDHX36更倾向于解旋dsDNA,而BtDHX36无明显倾向性。【结论】成功表达并纯化了BtDHX36和DmDHX36蛋白,确定了其最适结合条件,比较了2种DHX36解旋酶对不同底物的结合及解旋偏好。

关键词：牛DHX36解旋酶果蝇DHX36解旋酶蛋白表达纯化底物结合底物解旋

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

野猪DHX36解旋酶酶学特性及保守性分析

中国生物化学与分子生物学报 2022年第12期38卷 1681-1693页

作者：徐思颖郭海磊奚绪光西北农林科技大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室陕西杨凌712100

DHX36解旋酶(DEAH-box helicase 36)在生物体内广泛存在,可作为外源核酸传感器广泛参与机体免疫反应,因其对G-四链体具有高度亲和性和解旋活性而备受关注。目前已报道了3个物种DHX36解旋酶的三维结构,但其酶学活性的保守性研究鲜见报道... 详细信息

DHX36解旋酶(DEAH-box helicase 36)在生物体内广泛存在,可作为外源核酸传感器广泛参与机体免疫反应,因其对G-四链体具有高度亲和性和解旋活性而备受关注。目前已报道了3个物种DHX36解旋酶的三维结构,但其酶学活性的保守性研究鲜见报道。本文以哺乳动物野猪(Sus scrofa)DHX36解旋酶(SsDHX36)为研究对象,通过生物化学与生物物理研究技术系统研究了其酶学性质,并对比其与低等无脊椎动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)DHX36解旋酶(DmDHX36)的活性,探究DHX36在物种间的功能保守性。本研究通过原核表达系统,分离纯化得到了纯度大于95%的SsDHX36解旋酶;利用荧光偏振和快速停留技术得到SsDHX36的最佳酶学反应条件,发现SsDHX36对G4 DNA具有平行构型的亲和选择性,对富含鸟嘌呤的ssDNA具有结合和解旋的底物偏好性;结合单分子荧光共振能量转移技术对SsDHX36和DmDHX36进行活性比较,发现两者与G4 DNA结合的构型选择性和对富含鸟嘌呤DNA的底物偏好性是保守的。但两者对不同序列长度ssDNA的亲和性差异显著,SsDHX36受序列长度影响较大且亲和力随序列长度的增加而增强,而DmDHX36则完全相反。本文克隆纯化了SsDHX36解旋酶并研究了其酶学活性,着重分析了SsDHX36和DmDHX36的功能保守性,为理解DHX36的保守功能机制,探究基于DHX36与富含鸟嘌呤序列互作的免疫反应酶学活性基础和靶向药物设计提供了理论与实验基础。

关键词：野猪DHX36解旋酶 G-四链体酶学活性底物偏好性功能保守性

牛DHX36解旋酶及其突变体底物结合与解旋活性研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2021年第5期49卷 8-15,23页

作者：郭青青郭海磊刘娜女奚绪光西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

【目的】研究牛(Bos taurus)解旋酶DHX36(BtDHX36)及其突变体蛋白对含有G4结构底物结合和解旋活性的差异,为深入研究牛DHX36酶学特征和结构提供理论参考。【方法】制备底物16nt-ssDNA、Telomere G4和Telomere G4-16T,构建重组质粒pET15b... 详细信息

【目的】研究牛(Bos taurus)解旋酶DHX36(BtDHX36)及其突变体蛋白对含有G4结构底物结合和解旋活性的差异,为深入研究牛DHX36酶学特征和结构提供理论参考。【方法】制备底物16nt-ssDNA、Telomere G4和Telomere G4-16T,构建重组质粒pET15b-sumo-BtDHX36,通过Overlap PCR引入点突变,构建位于RSM区和OB域的突变重组质粒,分别将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达;经过Ni-NTA和Hi Trap SP HP柱纯化得到目的蛋白。以解离平衡常数为判定指标,利用荧光各向异性法(FA)对酶蛋白与底物结合时的KCl浓度(0,50和100 mmol/L)、反应温度(25,30和37℃)、MgCl 2浓度(0,2和5 mmol/L)、pH(6.5,7.5和8.5)进行优化,确定BtDHX36的体外最佳底物结合条件,比较野生型BtDHX36及其突变体对含有G4结构底物结合活性的差异。以解旋比例和速率常数为判定指标,利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,比较野生型BtDHX36及其突变体对G4结构的解旋活性差异。【结果】成功构建了野生型BtDHX36重组质粒pET15b-sumo-BtDHX36及其RSM区突变体BtDHX36 R63AI65A、BtDHX36 Y69A、BtDHX36 K76AN77AK78A和OB域突变体BtDHX36 Y862A的重组质粒,诱导表达纯化后得到了纯度大于95%的酶蛋白。确定了野生型BtDHX36的体外最佳底物结合条件为:KCl 50 mmol/L、MgCl 22 mmol/L、20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5、反应温度37℃。各突变位点均可降低酶蛋白与Telomere G4的结合活性。OB域的Y862A突变和RSM区K76AN77AK78A突变对酶蛋白解旋Telomere G4-16T活性均无明显影响;RSM区的R63AI65A和Y69A突变对酶蛋白解旋Telomere G4-16T均有较大影响。【结论】获得了高纯度的野生型BtDHX36及突变体酶蛋白,明晰了其体外最佳底物结合条件;RSM区的R63AI65A和Y69A突变均可明显降低酶蛋白解旋Telomere G4-16T的活性。

关键词：牛解旋酶 DHX36解旋酶解旋酶突变体 G4底物

厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2017年第6期45卷 206-212页

作者：郭海磊刘娜女段晓雷奚绪光西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

【目的】通过原核表达系统获得嗜热的厌氧棒菌(Anaerobaculum hydrogeniformans)DNA解旋酶Pif1(AnaPif1),研究其体外最佳解旋条件,为深入研究嗜热菌Pif1家族解旋酶工作机理提供参考。【方法】构建重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,将重组载... 详细信息

【目的】通过原核表达系统获得嗜热的厌氧棒菌(Anaerobaculum hydrogeniformans)DNA解旋酶Pif1(AnaPif1),研究其体外最佳解旋条件,为深入研究嗜热菌Pif1家族解旋酶工作机理提供参考。【方法】构建重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,将重组载体转入表达菌株BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱和Heparin柱纯化最终获得全长AnaPif1蛋白;利用停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,以pH值和Tris-HCl、NaCl、MgCl_2浓度及反应温度、能量供体为考察因素,以反应时间常数或速率常数为指标,摸索该蛋白在体外的最佳解旋条件、最佳能量供体以及底物的偏好性。【结果】成功构建了pET15b-sumo-AnaPif1重组表达载体,通过诱导表达,获得了纯度大于95%的全长AnaPif1蛋白,其大小为55ku,等电点为6.89。AnaPif1在体外的最佳解旋条件为:Tris-HCl(pH7.0)20mmol/L、NaCl 20mmol/L、MgCl_22mmol/L、反应温度37℃;其能够利用4种核苷三磷酸(ATP/GTP/CTP/UTP)作为能量供体,但对ATP有偏好性;该酶还能解旋多种底物(双链DNA、G4-DNA),且对底物选择无明显偏好性。【结论】获得了纯化的AnaPif1解旋酶,明晰了其最佳解旋条件、能量供体及底物的偏好性特征。

关键词：厌氧棒菌 Pif1解旋酶蛋白表达纯化 DNA解旋活性

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

新时期我国群众性体育赛事存在的问题

新时期我国群众性体育赛事存在的问题

2016至2017年CBA决赛新疆队与广东队攻防能力统计分析

2018年全国体育社会科学年会

作者：郭海磊陈冬陆军军事交通学院镇江校区军体教研室陆军军事交通学院镇江校区军政基础教研室

＜正＞1目的近日,国家发改委、体育总局等9部门联合印发《关于支持社会力量举办马拉松、自行车等大型群众性体育赛事行动方案（2017年）》（以下简称《行动方案》）,着力推进大型群众性体育赛事供给侧结构性改革,积极吸引社会力量参与...

＜正＞1目的近日,国家发改委、体育总局等9部门联合印发《关于支持社会力量举办马拉松、自行车等大型群众性体育赛事行动方案（2017年）》（以下简称《行动方案》）,着力推进大型群众性体育赛事供给侧结构性改革,积极吸引社会力量参与举办大型群众性体育赛事,扩大多层次多样化的体育赛事供给。《行动方案》指出,近年来,马拉松、自行车等大型群众性体育赛事快速发展,赛事数量迅速增加,产业规模不断扩大,但仍面临供给总量不足、服务质量有待提高、赛事内容缺乏创新等问题,群众性体育赛事作为社会体育中的重要组成部

关键词：

来源： cnki会议评论

在线全文

cnki会议

学校读者我要写书评

暂无评论

科技资讯 2018年第15期16卷 214-215页

作者：薛培育郭海磊无锡工艺职业技术学院体育部江苏宜兴214200 镇江船艇学院江苏镇江212000

运用文献资料法、录像分析法以及数理统计法对2016—2017年CBA决赛新疆队和广东队四场比赛进行分析。研究认为:CBA2016—2017赛季总决赛两支球队共性因子共4个,分别是防守反击能力、内线攻防能力、二次进攻能力以及快速反击能力。两支... 详细信息

运用文献资料法、录像分析法以及数理统计法对2016—2017年CBA决赛新疆队和广东队四场比赛进行分析。研究认为:CBA2016—2017赛季总决赛两支球队共性因子共4个,分别是防守反击能力、内线攻防能力、二次进攻能力以及快速反击能力。两支球队防守反击能力和二次进攻能力两支球队比较接近,内线攻防能力新疆队较广东队出色,快速反击能力广东队较新疆队出色。因子总得分新疆队高于广东队。

关键词： CBA决赛攻防能力统计分析

立足实际勇于创新奋力谱写濉溪县节水工作新篇章 004

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

立足实际勇于创新奋力谱写濉溪县节水工作新篇章

淮北日报

作者：郭海磊

濉溪县位于安徽省北部，地处苏鲁豫皖四省交界处，为淮北市唯一辖县，因古濉河与溪河交汇于此而得名，素有“酒乡煤城、中原粮仓、能源之都、运河故里”的美誉，全县辖11个镇，国土面积1987平方公里，总人口114万人。近年来，濉溪县深... 详细信息

濉溪县位于安徽省北部，地处苏鲁豫皖四省交界处，为淮北市唯一辖县，因古濉河与溪河交汇于此而得名，素有“酒乡煤城、中原粮仓、能源之都、运河故里”的美誉，全县辖11个镇，国土面积1987平方公里，总人口114万人。近年来，濉溪县深入贯彻落实习近平生态文明思想，积极践行“

关键词：节水型社会建设节约用水取水许可节水改造用水定额濉溪县用水效率节水工作

来源： cnki报纸评论

在线全文

cnki报纸

学校读者我要写书评

暂无评论

政府工作报告(摘要) 006

政府工作报告(摘要)