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猴痘病毒实时荧光PCR检测方法的建立

现代预防医学 2008年第11期35卷 2110-2112页

作者：幸芦琴李小波郑夔师永霞黄吉城相大鹏洪烨郭波旋 510700 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心卫生检疫实验室广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心卫生检疫实验室广州

[目的]建立快速、特异的猴痘病毒实时荧光PCR检测方法。[方法]制备猴痘病毒阳性核酸样本,设计并合成相应的扩增引物及荧光标记探针,摸索最佳反应条件。[结果]本方法对模拟猴痘病毒样本的检测灵敏度达到102拷贝/反应,具有快速、灵敏、较... 详细信息

[目的]建立快速、特异的猴痘病毒实时荧光PCR检测方法。[方法]制备猴痘病毒阳性核酸样本,设计并合成相应的扩增引物及荧光标记探针,摸索最佳反应条件。[结果]本方法对模拟猴痘病毒样本的检测灵敏度达到102拷贝/反应,具有快速、灵敏、较高的特异性和重复性,可在3h内准确检测出猴痘病毒核酸的能力。[结论]本方法适合国境口岸猴痘病毒快速检测,对防止猴痘病毒传入我国,保障国境卫生安全具有重要意义。

关键词：猴痘病毒实时荧光PCR

实时荧光RT-PCR技术在黄热病快速检测中的应用

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现代预防医学 2010年第4期37卷 715-717+721页

作者：师永霞相大鹏郑夔李小波黄吉城洪烨幸芦琴郭波旋广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

[目的]建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法并用于口岸黄热病的快速检测。[方法]体外转录黄热病病毒5-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索最佳反应体系条件并用于黄热... 详细信息

[目的]建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法并用于口岸黄热病的快速检测。[方法]体外转录黄热病病毒5-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索最佳反应体系条件并用于黄热病疫苗和入境发热患者标本的检测。[结果]建立的黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:2×RT-PCR缓冲液10μl,正向引物5UTR-FP终浓度750nM,反向引物5UTR-RP终浓度750nM,探针5UTR-Probe终浓度500nM,25×RT-PCR Enzyme Mix 0.8μl,RNA5μl,用DEPCH2O补足到反应总体积20μl。;Roche lightcycler仪器适用的扩增程序为:45℃10min,95℃10min;95℃5s,56℃10s(single),72℃15s,45次循环。该方法最低检测限约为20copies病毒/反应,与登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒无交叉反应。应用该方法对黄热病疫苗、媒介蚊虫和入境发热患者的血清标本进行检测,结果为黄热病疫苗核酸阳性,其他标本为阴性。[结论]该实时荧光RT-PCR方法灵敏度高,特异性强,适用于黄热病病毒的快速检验,防止该病在国境口岸的传入。

关键词：黄热病病毒 5’端非编码区实时荧光RT-PCR 快速检测

60mer寡核苷酸芯片制备及杂交系统的优化

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现代预防医学 2008年第18期35卷 3600-3601+3604页

作者：张海燕马文丽黄吉城商涛廖之君郭波旋郑文岭广州军区广州总医院医学实验科广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心南方医科大学基因工程研究所

[目的]寡核苷酸芯片制备及杂交过程中的影响因素很多,本实验针对其中主要影响因素进行优化,以筛选出最佳的条件,对芯片制备及杂交系统进行优化。[方法]通过改变芯片打印加样量、斑点数和不同探针浓度,挑选出芯片制备的实验条件;采用正... 详细信息

[目的]寡核苷酸芯片制备及杂交过程中的影响因素很多,本实验针对其中主要影响因素进行优化,以筛选出最佳的条件,对芯片制备及杂交系统进行优化。[方法]通过改变芯片打印加样量、斑点数和不同探针浓度,挑选出芯片制备的实验条件;采用正交试验法,以信噪比(SNR值)为评估指标,分析芯片杂交的最佳条件。[结果]最佳实验条件为:增加预打印斑点数,探针浓度为1μg/μl,与纯化后的荧光标记样品在50%甲酰胺,10×SSC,0.2%SDS杂交液中42℃杂交4h,洗脱液每次洗脱时间为1min。[结论]此方法适用于60mer寡核苷酸芯片的制备及杂交效率的提高。

关键词：寡核苷酸芯片正交试验优化

从甲型H1N1流感疫情检测看口岸卫生检疫实验室技术水平配备需求

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口岸卫生控制 2010年第2期15卷 13-15页

作者：李小波黄吉城相大鹏郭波旋广东出入境检验检疫局广州510700

目的介绍笔者所在的广东局技术中心卫生检疫(BSL-3)实验室成立四年以来在实验室仪器设备、技术力量等方面的发展历程及在此次"甲流"疫情防控(实验室检测)中发挥的重大技术保障作用,总结国境口岸卫生检疫实验室技术力量发展需求,为该系... 详细信息

目的介绍笔者所在的广东局技术中心卫生检疫(BSL-3)实验室成立四年以来在实验室仪器设备、技术力量等方面的发展历程及在此次"甲流"疫情防控(实验室检测)中发挥的重大技术保障作用,总结国境口岸卫生检疫实验室技术力量发展需求,为该系统相关实验室建设发展提供技术参考。方法在2009年甲型H1N1流感疫情席卷全球的大背景下,广东局技术中心卫生检疫实验室充分发挥了自身强大的科技优势,做到"技术精湛,作风顽强,保障有力",为甲流疫情的防控做出了重大贡献。结果笔者认为广东局卫检实验室成功的案例具有广泛的示范意义,其实验室定位,硬、软件建设及人员结构等均值得系统内同类实验室借鉴。结论国境卫生检疫工作大有可为;国境卫生检疫实验室在发展过程中应更专业化、规范化,紧密结合《中华人民共和国国境卫生检疫法》要求及国内外疫情最新流行趋势,同时结合口岸一线检疫查验工作实际,快出成绩,多出成绩,以推动卫生检疫工作取得更大的进步。

关键词：甲型H1N1流感口岸卫生检疫

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传染病的国境卫生检疫对策

旅行医学科学 2007年第2期13卷 15-18页

作者：师永霞李小波幸芦琴郭波旋广东出入境检验检疫局广州510700

为了探讨传染病的国境卫生检疫对策,作者从国境卫生检疫的起源、目的、检疫查验、传染病监测、卫生监督等方面介绍了国境卫生检疫与检疫传染病、监测传染病的关系,分析了检验检疫机关防止传染病传入传出采取的措施和卫生处理手段。作者... 详细信息

为了探讨传染病的国境卫生检疫对策,作者从国境卫生检疫的起源、目的、检疫查验、传染病监测、卫生监督等方面介绍了国境卫生检疫与检疫传染病、监测传染病的关系,分析了检验检疫机关防止传染病传入传出采取的措施和卫生处理手段。作者认为随着国际贸易的发展,现代交通工具的多样化和新发传染病的发生,给传染病的蔓延创造了更加便捷的条件,这些都给国境卫生检疫工作提出了严峻的挑战。因此,从3个方面提出了传染病防控的国境卫生检疫对策:检验检疫机关应加强国境口岸检疫查验和传染病监测,健全和完善国境口岸传染病监测体系,配置专业人才,提高人员素质更好适应严峻的国际疫情形势。

关键词：国境卫生检疫传染病检疫查验传染病监测卫生监督

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1例国内罕见的输入性卵形疟的实验室检测

中国人兽共患病学报 2011年第10期27卷 914-917,920页

作者：师永霞黄吉城苏锦坤李小波幸芦琴郑夔洪烨郭波旋广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心卫生检疫实验室广州510700

目的对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法制备疑似疟疾患者血样的血涂片,吉姆萨染色后进行疟原虫的镜检观察。利用实验室自行研制的疟原虫属特异性(通用型)和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和实时荧光PCR检测方法,对该血样... 详细信息

目的对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法制备疑似疟疾患者血样的血涂片,吉姆萨染色后进行疟原虫的镜检观察。利用实验室自行研制的疟原虫属特异性(通用型)和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和实时荧光PCR检测方法,对该血样进行疟疾检测及分型。将PCR扩增片段进行序列测定,并与已知的卵形疟序列进行blast比对分析。结合血样的分子生物学检测结果,重新对镜检结果进行复核。结果血样初次镜检为疟疾阴性。使用疟原虫巢式PCR通用引物对血样的DNA进行PCR检测,扩增出了预期大小约240bp的条带;巢式PCR分型检测表明,血样仅扩增出预期大小约450bp的卵形疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和三日疟扩增条带产生。疟原虫通用型和卵形疟特异性的荧光PCR检测结果均为典型的S形阳性曲线,卵形疟扩增片段的熔解温度为72.5℃。序列分析表明,扩增片段长度为434bp,blast比对发现去除引物后的393个碱基与GenBank DQ845247等卵形疟的SSU rRNA对应部分的基因序列同源性为100%。重新对血涂片进行镜检复核,结果在薄血膜中发现了卵形疟的环状滋养体,被寄生的红细胞为椭圆形,边缘呈伞矢状。结论使用巢式PCR、实时荧光PCR、序列分析和镜检等方法,证实该例输入性的疑似疟疾患者为卵形疟原虫感染。

关键词：输入性卵形疟镜检巢式PCR 实时荧光PCR 序列分析

抗人禽流感病毒H5N1人源化单链抗体噬菌体文库的构建和筛选

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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第10期29卷 890-893页

作者：黄吉城武婕郭波旋张宏斌相大鹏师永霞李小波洪烨郑夔幸芦琴杨晓广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心广州510623 广东省疾病预防控制中心广州军区广州总医院

目的利用抗人禽流感病毒H5N1 IgG抗体阳性的人禽流感康复患者外周血淋巴细胞，构建人源化Fv段单链抗体（scFv）噬菌体文库，并筛选与禽流感病毒相关蛋白有结合活性的scFv抗体文库。方法提取人外周血淋巴细胞总RNA，逆转录成cDNA，以其... 详细信息

目的利用抗人禽流感病毒H5N1 IgG抗体阳性的人禽流感康复患者外周血淋巴细胞，构建人源化Fv段单链抗体（scFv）噬菌体文库，并筛选与禽流感病毒相关蛋白有结合活性的scFv抗体文库。方法提取人外周血淋巴细胞总RNA，逆转录成cDNA，以其为模板，利用家族特异性IgG基因的引物，扩增重链和轻链的可变区基因，并用合成的连接子将轻链和重链基因连接成单链抗体片段后，重组到噬菌粒载体pCANTAB5E中。将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌TG1，酶切和PCR鉴定抗体库的重组率，通过测定噬菌体抗体库的滴度计算抗体库的库容，用特异性禽流感病毒相关蛋白筛选表达的单链抗体。结果构建了源于人禽流感康复患者血清的scFv抗体文库，库容为3．75×10^4；筛选出与禽流感病毒相关蛋白有结合活性的scFv抗体文库。结论成功构建了抗人禽流感病毒H5N1的人源scFv噬菌体抗体库，并筛选出特异性结合人禽流感病毒相关蛋白的单链抗体，为进一步制备快速检测试剂和治疗研究提供了基础数据。

关键词：人禽流感病毒H5N1 人源化单链抗体噬菌体文库构建筛选

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委内瑞拉马脑炎的研究进展

旅行医学科学 2008年第2期14卷 1-3页

作者：洪烨师永霞黄吉城幸芦琴郑夔李小波相大鹏郭波旋广东出入境检验检疫局广州510700

委内瑞拉马脑炎(Venezuelan equine encephalitis,VEE)是由委内瑞拉马脑炎病毒复合物(VEEV复合物)引起的自然疫源性疾病,历史上引起了多次暴发流行。VEEV还是一种潜在的、可以用于战争和恐怖活动的生物武器。本文就VEE的病原学、流行病... 详细信息

委内瑞拉马脑炎(Venezuelan equine encephalitis,VEE)是由委内瑞拉马脑炎病毒复合物(VEEV复合物)引起的自然疫源性疾病,历史上引起了多次暴发流行。VEEV还是一种潜在的、可以用于战争和恐怖活动的生物武器。本文就VEE的病原学、流行病学、临床表现、实验室检测、治疗和预防等方面予以综述。

关键词：委内瑞拉马脑炎病原学流行病学自然疫源性疾病

2009—2010年广东国境口岸军团菌检测结果及分析

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中国国境卫生检疫杂志 2011年第1期34卷 14-16页

作者：幸芦琴李小波洪烨苏锦坤师永霞郭波旋黄吉城广东出入境检验检疫局技术中心卫生检疫实验室广东广州510700

目的对广东地区国境口岸中央空调冷凝水进行军团菌检测,调查军团菌各血清型在口岸的分布规律。方法通过对2009—2010年广东地区国境口岸中央空调冷凝水的采集、处理,利用分离培养、乳胶凝集试验、血清学分型等方法对样本进行军团菌的检... 详细信息

目的对广东地区国境口岸中央空调冷凝水进行军团菌检测,调查军团菌各血清型在口岸的分布规律。方法通过对2009—2010年广东地区国境口岸中央空调冷凝水的采集、处理,利用分离培养、乳胶凝集试验、血清学分型等方法对样本进行军团菌的检测及血清学分型,并对检测结果进行统计分析。结果 2009年共检测口岸中央空调水样16批,检测样本42份,从中检出军团菌12例,阳性率为28.56%,其中嗜肺军团菌11例;2010年1-8月检测样本10批,从48份样本中检出军团菌21例,阳性率为43.75%,全部为嗜肺军团菌。结论 2010年度军团菌检出率明显高于2009年,阳性样本中嗜肺军团菌L1型占比率较大。

关键词：国境口岸军团菌中央空调血清型冷凝水