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碱蓬耐盐碱基因ScVP转化红花的研究

碱蓬耐盐碱基因ScVP转化红花的研究

作者：郭咏昕吉林农业大学

学位级别：硕士

目前,我国的土地盐碱化已经日趋严重,已经成为了一个全球性的问题。在这些盐碱地区仅有少数几种植物生长。因此,我们面临的一个炙手可热的问题就是如何改善盐碱土从而降低盐碱地的面积。随着现在分子生物技术和基因工程的研究和日趋完善... 详细信息

目前,我国的土地盐碱化已经日趋严重,已经成为了一个全球性的问题。在这些盐碱地区仅有少数几种植物生长。因此,我们面临的一个炙手可热的问题就是如何改善盐碱土从而降低盐碱地的面积。随着现在分子生物技术和基因工程的研究和日趋完善,有很多的研究已经把耐盐和耐旱的基因成功到克隆到植物体内,开辟了选择植物品种的又一个新的途径。红花(Carthamus tinctorius L.)为菊科(Compositae)红花属一年生的草本植物。埃及,巴基斯坦,印度等地区都有种植,从汉代引入到我国已有二千一百年的历史。红花不仅作为油药两用的作物,还可作为天然的食用色素。在我国主产于新疆地区,具有耐盐耐旱的特点。 ScVP基因是由碱蓬分离出的液泡膜H+-PPase基因。H+-PPase (pyrophosphatase, PPase)即为焦磷酸酶,它是一种以焦磷酸为底物的水解酶。H+-PPase作为质子泵将细胞质中的H+泵入到细胞中,这样不仅可以使细胞的离子平衡和渗透平衡,还能减轻无机离子对细胞质的毒害。曾有人做了有关耐盐碱的实验,通过对转入了碱蓬H+-PPase基因的苜蓿进行分子生物学检测,发现了超表达ScVP转基因苜蓿的耐盐性和耐旱性都有着明显的升高。利用农杆菌介导外源基因的转化技术已经取得了显著的进展,迄今为止,已经有二百多种转基因植物是通过这种转化技术产生的。 1.本实验是通过根瘤农杆菌介导法,用含有ScVP基因的农杆菌转化红花,最终得到含有耐高pH盐碱的转基因新品系红花植株。 2.红花再生芽在含有植物生长激素6-BA的伸长培养基上进行优化,选择含有0mg/L,0.5mg/L,1.0mg/L,1.5mg/L,2.0mg/L,2.5mg/L的植物生长激素的6-BA。最终确定1.0mg/L的6-BA浓度为最适合红花再生芽生长的激素条件。 3.用农杆菌介导法转化红花,并在含有1.5mg/L的Basta的培养基上筛选阳性苗。 4.通过分子生物学检测,即PCR, Southern杂交结果分析,证实了ScVP基因已整合到红花基因组中,并有所表达。

关键词： H+焦磷酸化酶 SvVP 农杆菌转基因红花

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CPU热管散热器的实验研究

低温与超导 2020年第7期48卷 56-60页

作者：郭咏昕张亚平姬长发西安科技大学西安710054

为探究热管散热器的散热性能,选取使用热管数量分别为两根、四根、六根的三种重力式热管散热器为研究对象进行实验。这三种热管散热器热管与翅片的结构型式相同,翅化比均接近13.5,因此具有较高的可比性。在风速为1.7 m/s的工况下,测得... 详细信息

为探究热管散热器的散热性能,选取使用热管数量分别为两根、四根、六根的三种重力式热管散热器为研究对象进行实验。这三种热管散热器热管与翅片的结构型式相同,翅化比均接近13.5,因此具有较高的可比性。在风速为1.7 m/s的工况下,测得了两热管散热器最大散热功率为78 W,总热阻为0.57 K/W;四热管散热器最大散热功率为116 W,总热阻为0.36 K/W;六热管散热器最大散热功率为240 W,总热阻为0.19 K/W。六管散热器蒸发端与冷凝端均温性较好,三种热管散热器达到热平衡的时间约为17 min。

关键词：热管散热器散热功率热阻散热性能

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转VEGF_(165)基因红花的研究

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2014年第11期42卷 146-150页

作者：冯鹤冯雪郭咏昕强卫东王清曼邹德毅吴治邦杨晶吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心吉林长春130118

【目的】构建转血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的红花,为利用植物生物反应器规模化生产VEGF165奠定基础。【方法】采用PCR方法,克隆获得植物偏好性的VEGF165基因,将其与pOP质粒连接,构建重组质粒pOP-VEGF165,对其进行NcoⅠ和HindⅢ... 详细信息

【目的】构建转血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的红花,为利用植物生物反应器规模化生产VEGF165奠定基础。【方法】采用PCR方法,克隆获得植物偏好性的VEGF165基因,将其与pOP质粒连接,构建重组质粒pOP-VEGF165,对其进行NcoⅠ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定。采用冻融法将质粒pOP-VEGF165转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导获得转化红花植株,经PCR鉴定得到转基因红花阳性植株。【结果】克隆获得了495bp的VEGF165基因片段,并成功构建了植物特异表达载体pOP-VEGF165,用其转化红花子叶后,共获得了8株转基因红花植株,其中2株鉴定为阳性。【结论】获得了转VEGF165基因的红花株系。

关键词：血管内皮生长因子红花遗传转化

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红花油体表达人透明质酸酶基因的初步研究

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2015年第9期43卷 191-195页

作者：杨晶李洪锐易善勇郭咏昕黄建卢震李海燕李校堃姜潮吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心吉林长春130118

【目的】获得转人源透明质酸酶基因PH20(hPH20)红花,为hPH20药用蛋白的生产奠定基础。【方法】人工合成hPH20基因,并在两端引入NcoⅠ/HindⅢ酶切位点。将合成的hPH20基因与pUC57载体连接,构建克隆载体pUC57-hPH20,对其进行双酶切鉴定。... 详细信息

【目的】获得转人源透明质酸酶基因PH20(hPH20)红花,为hPH20药用蛋白的生产奠定基础。【方法】人工合成hPH20基因,并在两端引入NcoⅠ/HindⅢ酶切位点。将合成的hPH20基因与pUC57载体连接,构建克隆载体pUC57-hPH20,对其进行双酶切鉴定。用NcoⅠ/HindⅢ酶切pUC57-hPH20获得hPH20基因,将其插入到植物油体高效表达载体pOBT上,构建重组质粒pOBT-hPH20,进行PCR和双酶切鉴定。采用冻融法将重组质粒pOBT-hPH20转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,对转hPH20基因红花植株进行PCR检测。【结果】成功构建了hPH20基因的植物油体表达载体pOBT-hPH20,获得了3株PCR检测呈阳性的转hPH20基因红花植株。【结论】建立了完善的红花再生体系,获得了转hPH20基因的红花植株。

关键词：红花透明质酸酶hPH20 油体

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金属硫蛋白2基因在红花中表达的初步研究

中草药 2016年第12期47卷 2152-2156页

作者：官丽莉陈昱武云云滕孝花杨晶郭咏昕胡人阁李海燕李校堃姜潮吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118 吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心吉林长春130118 通化市第一中学吉林通化134001

目的获得转金属硫蛋白2(metallothionein 2,MT2)红花植株,为MT药用蛋白的生产奠定基础。方法采用Nco I/HindⅢ酶切pEASY-oleosin-MT获得oleosin-MT融合基因,将其插入到植物油体高效表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT,进行PCR和... 详细信息

目的获得转金属硫蛋白2(metallothionein 2,MT2)红花植株,为MT药用蛋白的生产奠定基础。方法采用Nco I/HindⅢ酶切pEASY-oleosin-MT获得oleosin-MT融合基因,将其插入到植物油体高效表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT,进行PCR和双酶切鉴定。采用冻融法将重组质粒pOP-oleosin-MT转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,对转MT基因红花植株进行PCR检测及Southern blotting检测。结果成功构建了MT基因的植物油体表达载体pOP-oleosin-MT,获得了3株PCR检测呈阳性的转MT基因红花植株。结论建立了完善的红花再生体系,获得了转MT基因的红花植株。

关键词：红花金属硫蛋白油体 Southern blotting检测根瘤农杆菌重组质粒

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5种植物油体性质的比较

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2015年第2期43卷 223-227页

作者：齐玉红强卫东王清曼邹德毅卢震郭咏昕官丽莉杜林娜杨晶吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心吉林长春130118 吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118

【目的】对5种植物油体的大小、结构及稳定性进行考察,为选择优质的植物油体奠定基础。【方法】利用PBS作为缓冲液,采用梯度离心法,提取水稻、亚麻芥、黄豆、黑豆和红花5种植物的油体,对这5种油体的外观进行观察;在倒置显微镜(10倍目镜... 详细信息

【目的】对5种植物油体的大小、结构及稳定性进行考察,为选择优质的植物油体奠定基础。【方法】利用PBS作为缓冲液,采用梯度离心法,提取水稻、亚麻芥、黄豆、黑豆和红花5种植物的油体,对这5种油体的外观进行观察;在倒置显微镜(10倍目镜×40倍物镜)下对5种植物油体的显微结构进行考察;用Mastersizer 2000激光粒度仪测定5种植物油体的粒径,同时比较于4℃放置15d后5种油体的粒径变化情况;通过SDS-PAGE电泳明确5种植物油体蛋白的分布情况。【结果】与其他植物油体相比,红花油体色泽洁白、透亮,分布均匀,粒径呈单一峰型,且峰型平滑。红花油体粒径为0.4~11.0μm,多数集中在1.75~2.05μm,水稻、亚麻芥、黄豆、黑豆油体粒径分别为0.5~12.0,0.3~11.0,0.4~13.0,0.4~13.0μm。在4℃放置15d后,5种植物油体的粒径增大,油体中均有杂峰出现,峰型不规则。SDS-PAGE电泳检测结果显示,5种植物油体相关蛋白主要分布在20.1~44.3ku。【结论】红花油体较其他植物油体结构规则,分散均匀,应用前景广阔。

关键词：油体显微结构粒径

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转角质细胞生长因子-2基因红花研究

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2015年第2期43卷 210-216页

作者：杨晶王兰黄建陈玉斌郭咏昕易善勇官丽莉杜林娜李海燕李校堃姜潮吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心吉林长春130118

【目的】构建转角质细胞生长因子-2基因(KGF2)红花,为KGF2药用蛋白的生产奠定了基础。【方法】利用融合PCR方法扩增人源KGF2基因与拟南芥油体蛋白Oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建了重组质粒pOP-OL-KGF2,采用... 详细信息

【目的】构建转角质细胞生长因子-2基因(KGF2)红花,为KGF2药用蛋白的生产奠定了基础。【方法】利用融合PCR方法扩增人源KGF2基因与拟南芥油体蛋白Oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建了重组质粒pOP-OL-KGF2,采用冻融法将质粒pOP-OL-KGF2转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,采用PCR检测筛选转基因红花阳性植株,SDS-PAGE检测Oleosin-KGF2融合蛋白的表达情况。【结果】成功构建了植物特异表达载体pOP-OL-KGF2,转染后共获得了12株转基因红花植株,其中2株鉴定为阳性,阳性率为17%,对转化植株进行DNA水平检测和蛋白水平检测,可知KGF2基因已经整合进红花基因组中,且有所表达。【结论】成功获得转KGF2基因的红花株系。

关键词：角质细胞生长因子-2 红花遗传转化

红花转录物组中筛选的Unigene100791基因克隆、生物信息学分析及功能预测

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食品工业科技 2016年第23期37卷 145-149,155页

作者：陈笑沈彦岐王清曼杜林娜卢玉彬强卫东郭咏昕王红雨杨莹杨晶魏健长春师范大学生命科学学院吉林长春130000 吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心吉林长春130118

目的:克隆红花Unigene100791基因,研究其表达情况;并对该基因的特性进行生物信息学分析,为后续红花代谢调控及提高红花油产量,使其满足食品工业市场需求奠定理论基础。方法:从红花转录物组数据库中筛选得到转录因子Dof相关基因Unigene10... 详细信息

目的:克隆红花Unigene100791基因,研究其表达情况;并对该基因的特性进行生物信息学分析,为后续红花代谢调控及提高红花油产量,使其满足食品工业市场需求奠定理论基础。方法:从红花转录物组数据库中筛选得到转录因子Dof相关基因Unigene100791的中间片段;利用RNAiso plus试剂法提取红花种子总RNA,利用RT-PCR方法反转录得到红花种子c DNA;采用3'Race方法从红花种子中克隆Unigene100791基因的全长序列;通过生物信息学方法对其全长基因进行分析,构建该基因与相关物种的系统进化树,研究其蛋白序列的同源性及其理化性质与结构特征,预测其生物学功能。结果:成功克隆了红花Unigene100791基因,其基因全长1274 bp;开放阅读框981 bp,编码326个氨基酸,理论分子质量约为35026.5 u,理论等电点9.5,带正电残基27个,带负电残基18个,序列含有典型的加尾信号poly(A);红花Unigene100791基因编码产物与烟草Dof2.4-1亲缘关系较近,属于Dof超家族,此蛋白存在信号肽,不存在跨膜结构。结论:成功克隆了红花Unigene100791基因,并对其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。

关键词：红花转录因子 Dof 克隆生物信息学

VP7-CTB融合蛋白在拟南芥种子中的表达及免疫原性分析

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中国兽医科学 2017年第4期47卷 403-410页

作者：李余先官丽莉周永刚刘秀明杨晶郭咏昕杨赫王红雨李海燕李校堃吉林农业大学教育部生物反应器与药物开发工程研究中心吉林长春130118 吉林农业科技学院中药学院吉林吉林132101 吉林农业大学中药材学院吉林长春130118 温州大学浙江温州325035

为了研发植物来源的轮状病毒疫苗,采用模式植物拟南芥作为生物反应器,将轮状病毒主要中和抗原基因VP7融合CTB,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥,获得了含有VP7-CTB的转基因拟南芥稳定株系,并分析其种子表达蛋白的免疫原性。首先,根据... 详细信息

为了研发植物来源的轮状病毒疫苗,采用模式植物拟南芥作为生物反应器,将轮状病毒主要中和抗原基因VP7融合CTB,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥,获得了含有VP7-CTB的转基因拟南芥稳定株系,并分析其种子表达蛋白的免疫原性。首先,根据拟南芥密码子的偏好性,设计合成优化的VP7和CTB基因,构建植物表达载体pPHAP1301-his-VP7-linker-CTB;再通过农杆菌介导的Floral Dip法转化拟南芥,收获T0代种子后播种,喷用草铵膦筛选转基因拟南芥获得T1代种子,重复上述过程最终获得T3代拟南芥种子,通过RT-PCR、W estern-bolt、ELISA等进行分析。结果表明,his-VP7-linker-CTB基因已成功整合到拟南芥的基因组并进行了转录和蛋白表达,并且VP7蛋白占总可溶性蛋白的0.39%,即转基因拟南芥种子中所含目的蛋白为52.65 g/g。最后,用转基因拟南芥稳定株系种子中的可溶性蛋白口服免疫小鼠,使小鼠获得免疫原性;乳鼠攻毒试验证明,母鼠免疫后产生的抗体能够有效传递给子代,具有很好的保护作用。

关键词：轮状病毒 VP7融合蛋白拟南芥免疫原性疫苗