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无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及生物活性的研究

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无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及生物活性的研究

作者：郭云萍第四军医大学

学位级别：硕士

研究背景硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）是一个分子量为12kDa的酸性小分子蛋白，具有热稳定性，其氨基酸序列中含有保守序列：胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-胱氨酸，为其活性中心，该活性中心含有调节氧化还原活性的二硫键/巯基。硫氧还蛋白... 详细信息

研究背景硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）是一个分子量为12kDa的酸性小分子蛋白，具有热稳定性，其氨基酸序列中含有保守序列：胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-胱氨酸，为其活性中心，该活性中心含有调节氧化还原活性的二硫键/巯基。硫氧还蛋白广泛存在于各类生物细胞中，具有多种生物学功能，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、调控基因表达等。临床和实验研究表明，硫氧还蛋白与癌症、艾滋病、类风湿性关节炎、糖尿病并发症、肝和肾疾病、白内障形成等多种人类疾病密切相关。已经证实，硫氧还蛋白可通过直接的抗氧化作用或蛋白-蛋白间相互作用发挥重要的心肌保护作用。现阶段使用的无标签重组人Trx（RecombinantHumanThioredoxin,rhTrx）制品大多数制备工艺复杂，难以扩大生产且成本高，价格昂贵，而带标签的重组人Trx，标记序列的不安全性可能限制其临床研究。这些都极大地限制了其作为候选新药的进一步研究。建立简便、廉价的rhTrx制备工艺是其大批量生产和进一步临床前试验研究和应用的关键。因此，本课题要解决的问题是：探索一个切实可行、经济有效的纯化、生产rhTrx的技术方案，实现大量制备具有生物活性的rhTrx的目的。研究目的 1.利用基因工程的方法构建无标签rhTrx的原核表达载体;检测重组人硫氧还蛋白工程菌BL21/pET-22b(+)-rhTrx生物学特性的稳定性;建立rhTrx中式发酵工艺、纯化工艺及初步质量规程。 2.利用胰岛素二硫键还原法分析rhTrx的体外活性，并通过研究rhTrx对小鼠心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤的影响分析其体内生物活性。实验方法 1.从人胚胎肾HEK293细胞中提取总RNA，提取的总RNA通过反转录合成cDNA，在经目的片段PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒。 2.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞构建表达目的蛋白rhTrx的工程菌，并对工程菌连续传代50代，对每10代工程菌进行透射电镜观察、革兰氏染色及各项生化指标的检测，同时观察菌中质粒的性状和蛋白表达水平，以研究工程菌的目的蛋白生产性能和生物学特性的稳定性。 ***诱导工程菌目的蛋白的表达，经两步离子交换层析纯化重组蛋白rhTrx，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白免疫印迹（Westernblotting）、高效液相色谱（HPLC）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对重组蛋白进行鉴定。 4.运用经典的胰岛素二硫键还原法测定rhTrx的体外生物学活性;rhTrx的体内生物学活性的检测利用小鼠心肌MI/R模型（缺血30min，再灌注3h、24h，再灌前10min给予小鼠腹腔注射rhTrx治疗）：再灌注3h后，检测心肌细胞凋亡、caspase-3活性;再灌注24h后检测心肌梗死面积和小鼠术后24h心功能变化。实验结果 1.成功构建了rhTrx基因表达载体。 2.从各代工程菌中提取的质粒经双酶切后均可见315bp的目的基因片段;各代工程菌中rhTrx蛋白的表达量均为菌体总蛋白的20%左右;透射电镜观察呈现典型的大肠杆菌特性;革兰染色显示为阴性杆菌;各项生化检测结果与原始菌种无显著差异。 3.实现了rhTrx在原核细胞中的可溶性表达;纯化出的蛋白经SDS-PAGE和Westernblotting分析证实为rhTrx;HPLC和MALDI-TOF-MS分析表明，纯化出的目的蛋白分子量正确，纯度大于95%。 4.体外实验证实rhTrx能够还原胰岛素二硫键;体内实验证实，与MI/R+Vehicle组相比，MI/R+rhTrx组小鼠心肌缺血再灌注损伤后的心梗面积减少（n=6，P<0.05），心肌细胞凋亡水平及caspase-3活性降低（n=6，P<0.01）。结论 1.成功构建了rhTrx的原核表达体系，证实BL21/pET-22b(+)-rhTrx工程菌生物学特性稳定，可作为生产用菌种，建立了rhTrx的中式发酵工艺、纯化工艺及初步质量规程。 2.本法纯化出的rhTrx具有较高的生物活性，对这一治疗心肌缺血/再灌注损伤候选新药的研究奠定了实验基础。

关键词：重组人硫氧还蛋白表达纯化心肌缺血/再灌注损伤生物活性

重组人硫氧还蛋白工程菌生物学特性稳定性的检测

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微生物学通报 2013年第8期40卷 1457-1461页

作者：郭云萍陶凌李刚任阳王慧峰太钢总医院山西太原030003 第四军医大学西京医院心内科陕西西安710032

【目的】观察和检测重组人硫氧还蛋白工程菌BL21/pET-22b(+)-rhTrx生物学特性的稳定性。【方法】工程菌连续传代50代,通过对每10代进行质粒性状、蛋白表达水平、透射电镜观察、革兰氏染色及各项生化检查,全面检测工程菌可能影响生产性... 详细信息

【目的】观察和检测重组人硫氧还蛋白工程菌BL21/pET-22b(+)-rhTrx生物学特性的稳定性。【方法】工程菌连续传代50代,通过对每10代进行质粒性状、蛋白表达水平、透射电镜观察、革兰氏染色及各项生化检查,全面检测工程菌可能影响生产性能的生物学特性稳定性。【结果】各代工程菌提取的质粒经双酶切后均可见315 bp的目的基因片段;各代工程菌中Trx蛋白的表达量均为菌体总蛋白的20%左右;透射电镜观察呈现典型的大肠杆菌特性;革兰染色显示为阴性杆菌;各项生化检测结果与原始菌种无显著差异。【结论】该菌种生物学特性稳定,可作为生产用菌种。

关键词：人硫氧还蛋白重组工程菌生物学特性稳定性

炎症性肠病与动脉粥样硬化性心血管疾病发生风险相关性的研究进展

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胃肠病学 2021年第10期26卷 627-630页

作者：李琼羽郭云萍连海峰滨州医学院附属医院消化内科 256603 滨州医学院

炎症性肠病(IBD)是一种常见的慢性炎症性疾病,在中国的发病率逐年升高。慢性炎症又是导致动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的重要原因之一。两者可能具有一定的相关性。IBD和ASCVD在流行病学、遗传学、环境因素等方面具有共同的病理生... 详细信息

炎症性肠病(IBD)是一种常见的慢性炎症性疾病,在中国的发病率逐年升高。慢性炎症又是导致动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的重要原因之一。两者可能具有一定的相关性。IBD和ASCVD在流行病学、遗传学、环境因素等方面具有共同的病理生理机制。许多与IBD相关的因素均可影响ASCVD的发生和发展。本文就IBD和ASCVD的共同病理生理机制以及相关治疗的研究进展作一综述。

关键词：炎症性肠病动脉粥样硬化性心血管疾病结肠炎,溃疡性 Crohn病治疗

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小儿眼外伤手术的护理配合

眼外伤职业眼病杂志 2006年第12期28卷 945-946页

作者：李荷花郭云萍费安裕浙江省台州医院手术室浙江临海317000

目的探讨小儿眼外伤手术护理配合的意义。方法对98例小儿眼外伤手术进行及时、有效和针对性的心理护理,以及密切的手术护理配合。结果协助医生顺利完成手术,未出现严重并发症,患儿视功能恢复良好。结论手术中护理配合对患儿眼外伤手术... 详细信息

目的探讨小儿眼外伤手术护理配合的意义。方法对98例小儿眼外伤手术进行及时、有效和针对性的心理护理,以及密切的手术护理配合。结果协助医生顺利完成手术,未出现严重并发症,患儿视功能恢复良好。结论手术中护理配合对患儿眼外伤手术顺利进行是必要的。

关键词：儿童眼外伤手术护理

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“1+3”模式对手术标本的风险管理

护士进修杂志 2011年第11期26卷 980-981页

作者：杨敏郭云萍牟月燕张红枫浙江省恩泽医疗集团台州医院浙江临海317000

＂1＋3＂模式是我院推行的一个简单又实用的质量改进工具,具体内容为针对一个事件或问题、分析寻找它的一些根本原因;制定一套合理的对策措施;然后再与一群人分享。这种善于发现问题的模式改变了我们的思维方式,减少盲目性,并促使我们... 详细信息

＂1＋3＂模式是我院推行的一个简单又实用的质量改进工具,具体内容为针对一个事件或问题、分析寻找它的一些根本原因;制定一套合理的对策措施;然后再与一群人分享。这种善于发现问题的模式改变了我们的思维方式,减少盲目性,并促使我们用科学有效的方法来解决,然后持续改进、不断完善。

关键词： “1+3”模式病理标本风险管理

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高校实验室化学废弃物的处理方法及对策

湖北函授大学学报 2012年第5期25卷 127-128页

作者：郭云萍广州大学化学化工学院广东广州510006

化学实验室废弃物如不加处理就任意排放,不仅会污染环境而且会造成浪费。本文论述了高校实验室化学废弃物的种类及其处理方法,在此基础上提出了若干简单可靠的处理对策。

关键词：高校实验室化学废弃物处理对策处理方法

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加强法律意识重视急诊手术护理

加强法律意识重视急诊手术护理

瘦素和BDNF在DSS诱导的小鼠结肠炎中的作用及其机制研究

全国第十届手术室护理学术交流暨专题讲座会议

作者：郭云萍浙江省台州医院手术室

加强法律知识学习,提高护士的法律意识,在为急诊手术病人、家属的访视沟通及术中谈议病情时,要注意场合及措词,以防不必要的误解。在工作中,明确角色、职责,做到严格遵守规章制度,按规范化操作,依法办事,约束和保护自己。使病人得到及... 详细信息

加强法律知识学习,提高护士的法律意识,在为急诊手术病人、家属的访视沟通及术中谈议病情时,要注意场合及措词,以防不必要的误解。在工作中,明确角色、职责,做到严格遵守规章制度,按规范化操作,依法办事,约束和保护自己。使病人得到及时的救治,减少不必要的纠纷。

关键词：手术室护士法律意识急诊手术护理医疗服务

来源： cnki会议评论

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胃肠病学 2022年第5期27卷 270-277页

作者：郭云萍连海峰李琼羽孙哲李丹胜利油田中心医院消化内科 257034 滨州医学院烟台附属医院消化内科滨州医学院附属医院消化内科滨州医学院护理学院

背景:瘦素、脑源性神经营养因子(BDNF)表达异常是溃疡性结肠炎(UC)发生的重要环节,但两者在UC中的作用机制尚不明确。目的:探讨瘦素、BDNF对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响及其机制。方法:选取36只雄性8~10周龄健康瘦素缺陷型ob小鼠和瘦素... 详细信息

背景:瘦素、脑源性神经营养因子(BDNF)表达异常是溃疡性结肠炎(UC)发生的重要环节,但两者在UC中的作用机制尚不明确。目的:探讨瘦素、BDNF对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响及其机制。方法:选取36只雄性8~10周龄健康瘦素缺陷型ob小鼠和瘦素正常表达的野生型(WT)小鼠,随机分为WT实验组、ob实验组、WT对照组、ob对照组。实验组小鼠给予3%DSS溶液自由饮用7 d诱导结肠炎模型,对照组给予蒸馏水。造模结束后评估小鼠疾病活动指数(DAI)评分、结肠长度、行为学状态和内脏敏感性,以实时荧光定量PCR法检测结肠和海马中瘦素、BDNF mRNA表达,蛋白质印迹法检测结肠BDNF蛋白表达。结果:与相应对照组相比,WT实验组和ob实验组小鼠DAI评分和内脏敏感性明显增高(P<0.05),结肠BDNF mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.05)。与WT对照组相比,WT实验组小鼠出现焦虑、抑郁样行为,海马中瘦素、BDNF mRNA表达显著降低(P<0.05)。相关性分析结果显示WT实验组小鼠焦虑与结肠长度呈正相关(P<0.05),与DAI评分呈负相关(P<0.05);抑郁、结肠BDNF mRNA表达与结肠长度呈负相关(P<0.05),与DAI评分呈正相关(P<0.05);海马中瘦素与焦虑呈正相关(P<0.05),与抑郁呈负相关(P<0.05);结肠BDNF mRNA表达与内脏敏感性呈负相关(P<0.05)。结论:结肠BDNF的分泌与瘦素表达有关,瘦素和BDNF能通过介导焦虑、抑郁情绪和内脏敏感性参与DSS诱导的小鼠结肠炎。

关键词：结肠炎,溃疡性瘦素脑源性神经营养因子焦虑抑郁内脏敏感性

全程护理干预在小儿哮喘雾化吸入治疗中的护理效果及对肺功能的影响观察

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中国科技期刊数据库医药 2022年第6期 94-96页

作者：郭云萍陕西省彬州市人民医院陕西咸阳713500

评估小儿哮喘雾化吸入时全程护理的价值。方法:以104例哮喘患儿为样本,均行雾化吸入治疗,此期间由监护人抽签分组,即全程组、普通组,样本于各组均是52例,前者行全程护理干预,后者行普通护理干预,研究在2021年5月-2022年5月实施,统计有效... 详细信息

评估小儿哮喘雾化吸入时全程护理的价值。方法:以104例哮喘患儿为样本,均行雾化吸入治疗,此期间由监护人抽签分组,即全程组、普通组,样本于各组均是52例,前者行全程护理干预,后者行普通护理干预,研究在2021年5月-2022年5月实施,统计有效率,记录恢复时间,检测肺功能,评估依从性。结果:哮喘护理后得到的有效率数据在全程组是98.08%(51例),计算后比普通组的84.62%(44例)高,P0.05。干预后通过PEF、FVC等指标了解各样本的肺功能,计算后在全程组比普通组高,P<0.05。哮喘护理后得到的依从率数据在全程组是96.15%(50例),计算后比普通组的80.77%(42例)高,P<0.05。结论:全程护理可推广,能增强肺功能,提高哮喘患儿依从性,且能缩短哮喘恢复时间,达到较高的有效率。

关键词：小儿哮喘临床影响雾化吸入恢复时间全程护理干预