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新型跨膜蛋白-脂质体生物色谱制备和应用方法学研究

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新型跨膜蛋白-脂质体生物色谱制备和应用方法学研究

作者：郑乐艺中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

跨膜蛋白属于膜蛋白的一种,是镶嵌于脂质双分子层中,两端暴露于细胞膜内外表面的蛋白质,在维持细胞功能方面起到十分重要的作用。跨膜蛋白是目前最主要的药物作用靶点,占到现阶段所有已知药靶的70%。因此,基于跨膜蛋白的药物发现是创新... 详细信息

跨膜蛋白属于膜蛋白的一种,是镶嵌于脂质双分子层中,两端暴露于细胞膜内外表面的蛋白质,在维持细胞功能方面起到十分重要的作用。跨膜蛋白是目前最主要的药物作用靶点,占到现阶段所有已知药靶的70%。因此,基于跨膜蛋白的药物发现是创新药物研发的重要途径,也一直是世界范围药学领域的研究热点。本课题着眼于跨膜蛋白,建立了一种新型的跨膜蛋白-脂质体生物色谱系统,并从以下三个方面开展论述。1、新型跨膜蛋白-脂质体-硅胶固定相合成与方法学考察跨膜蛋白结构复杂,具有一个或多个疏水性的跨膜区,其纯化重组以及保存都离不开去污剂的存在。但是在去污剂存在的环境下,蛋白的结构和功能均遭到一定的破坏,药物与跨膜蛋白的相互作用也与体内实际情况差别较大。针对体外模拟跨膜蛋白天然构建这一难题,相关学者发展了一系列新的模型和分析技术,其中最具有代表性的就是蛋白脂质体重构技术,其原理是使用各种脂质体重组形成模拟细胞膜环境的人工膜,然后将跨膜蛋白镶嵌于其上,体外模拟跨膜蛋白天然构建和环境,来表征其与药物的相互作用。然而,蛋白脂质体不具备刚性结构,不能作为色谱固定相,因此无法适用于快速便捷的液质联用这类高效的药物分析方法。为了解决这个问题,本章参考了蛋白脂质体重构技术以及本课题组先前已有基础的细胞膜色谱技术,选用细菌视紫红质作为模型蛋白,构建了一种新型的细菌视紫红质-脂质体-硅胶固定相,其原理是使用薄膜超声水化法将多种脂质体结合制备成囊泡状并将细菌视紫红质蛋白镶嵌于其上,而后使用真空涡旋法将细菌视紫红质-脂质体复合物键合上硅胶。制备的同时使用粒径测试仪,扫描电镜,共聚焦显微镜等多种方式考察制备路径中的各项物理参数。固定相制备完成后,使用湿法装柱将合成的固定相填装进色谱柱,使用9-顺式视黄醛作为阳性药,地塞米松作为阴性药考察色谱柱的有效性,使用9-顺式视黄醛连续进样7天考察色谱柱寿命。一系列实验证明,该方法成功将蛋白,脂质体,硅胶三者结合到一起,制备了一种可以作为色谱固定相的新型复合物,通过液质联用进行验证也证明其有效性和寿命符合要求,为之后该方法的进一步推广和应用奠定了基础。2、全二维FZD4-C18柱/TOF-MS色谱系统细胞膜色谱法是生物色谱法的一种,具有快速、灵敏的特点,十分适用于中药复杂体系的活性成分筛选。然而,尽管细胞膜色谱已经经过多年发展,其仍然有两点不足,一是靶细胞膜上含有成百上千种跨膜蛋白,药物与靶蛋白结合的专属性会受到干扰。即使是外源性转入特定蛋白表达载体的高表达细胞系,也无法消除大量细胞生存必须的其它跨膜蛋白的影响。二是靶细胞膜上的目标跨膜蛋白无法准确定量,且蛋白本身丰度低,相互作用分析的准确度和灵敏度会受到影响。因此,本章节在课题组前期细胞膜色谱研究的基础上,结合上一章节的新型固定相研究,发展了一种新型的全二维跨膜蛋白-脂质体生物色谱系统。本课题选取卷曲蛋白受体4,建立了全二维FZD4-C18柱/TOF-MS色谱系统。FZD4是七次跨膜蛋白,属于卷曲蛋白家族的一员,有众多研究证明FZD4是通过影响WNT/β-catenin通路从而导致结肠腺癌,膀胱癌等癌症的潜在靶点。通过构建的全二维色谱系统,筛选中药葛根、黄芩中作用于FZD4蛋白的潜在抗癌活性成分。通过事先建立的中药成分数据库与质谱结果的比对,再排除于空白对照色谱上呈阳性保留的假阳性结果后,本章节在全二维FZD4色谱系统上发现葛根中的潜在活性成分5种,黄芩中的潜在活性成分7种。3、葛根、黄芩中与FZD4可能存在相互作用的活性成分的药效验证本课题已经于上一章节建立了全二维FZD4-C18柱/TOF-MS色谱系统,并从中药葛根、黄芩中筛选与FZD4存在相互作用的潜在抗癌活性成分,从这些成分中挑选能够购买得到的部分成分的标准品即葛根中的葛根素和3'-羟基葛根素,黄芩中的千层纸素A、汉黄芩素与棕榈酸甲酯进行后续实验。为了验证这些成分的抗癌活性,本章节选取人乳腺癌细胞,进行了一系列实验。首先,细胞增殖抑制实验结果显示千层纸素A、汉黄芩素和葛根素对MCF7细胞具有杀伤作用。其次,使用流式细胞仪进行细胞凋亡实验,结果显示千层纸素A、汉黄芩素和葛根素是通过凋亡途径杀伤细胞。随后进行的蛋白免疫印迹实验结果显示汉黄芩素与葛根素能显著降低MCF7细胞中FZD4的表达,其余化合物则不能。最后,使用Discovery Studio 3.0软件进行汉黄芩素、葛根素与FZD4蛋白的虚拟对接,结果显示汉黄芩素、葛根素能通过氢键与FZD4蛋白结合位点的氨基酸相连。

关键词：跨膜蛋白脂质体全二维色谱中药抗癌活性成分筛选

手性固定相HPLC法测定大鼠血浆阿罗洛尔对映体及药代动力学研究

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药物分析杂志 2015年第9期35卷 1539-1543页

作者：许艳海陈朗东方俊聪郑乐艺张劲柏闻俊洪战英柴逸峰范国荣第二军医大学药学院上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室中国人民解放军69339部队中国人民解放军96123部队

目的：建立大鼠血浆中阿罗洛尔对映体的HPLC定量分析方法,并研究盐酸阿罗洛尔片在Wistar大鼠体内的手性药代动力学特征。方法：血浆样品采用液-液萃取的方法进行前处理。采用Chiralpak AD-H（250 mm×4.6 mm,5μm）手性色谱柱,正己烷-乙... 详细信息

目的：建立大鼠血浆中阿罗洛尔对映体的HPLC定量分析方法,并研究盐酸阿罗洛尔片在Wistar大鼠体内的手性药代动力学特征。方法：血浆样品采用液-液萃取的方法进行前处理。采用Chiralpak AD-H（250 mm×4.6 mm,5μm）手性色谱柱,正己烷-乙醇-二乙胺-三乙胺（30∶70∶0.1∶0.1）为流动相,流速0.4 m L·min-1,检测波长315 nm。结果：d-阿罗洛尔和l-阿罗洛尔质量浓度均在0.025~1.25μg·m L^-1范围内线性关系良好（r^2〉0.99）。阿罗洛尔对映体的回收率均大于94.1%,日内、日间RSD均小于15%。应用本文方法测定Wistar大鼠灌胃给药阿罗洛尔后的各对映体血浆浓度,获得相应的药动学参数,d-阿罗洛尔和l-阿罗洛尔的Cmax、AUC0-∞分别为0.225μg·m L^-1、1.82μg·h·m L^-1和0.226μg·m L^-1、1.84μg·h·m L^-1。结论：该方法经方法学验证,可用于阿罗洛尔对映体在大鼠体内药代动力学研究,发现阿罗洛尔对映体在大鼠血浆药动学特征不存在立体选择性。

关键词：阿罗洛尔手性药物检测对映体手性固定相液-液萃取药代动力学高效液相色谱

我国互联网药品零售情况及基于上海市民的认知、态度、行为调查

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中国药房 2016年第15期27卷 2028-2031页

作者：徐富张劲柏郑乐艺李箫舒丽芯第二军医大学药学院药学队上海200433 第二军医大学药学院药事管理与临床药学教研室上海200433

目的:为促进我国互联网药品交易服务的进一步发展提供参考。方法:通过网络收集和统计我国的网上药店审批数据以及销售额排序前20位网上药店的销售品种数据并评估其经营规范性;同时,通过问卷调查上海部分市民对于互联网药品零售的认知情... 详细信息

目的:为促进我国互联网药品交易服务的进一步发展提供参考。方法:通过网络收集和统计我国的网上药店审批数据以及销售额排序前20位网上药店的销售品种数据并评估其经营规范性;同时,通过问卷调查上海部分市民对于互联网药品零售的认知情况、购药经历及相关需求并进行分析。结果:截至2015年6月12日,经批准取得《互联网药品交易服务许可证》的零售连锁药店(简称网上药店)共307家,仅有62家(20.2%)经营规范性完全符合相关规定;2014年销售额排序前19位的网上药店(排除1家仅销售医疗器械的网上药店)平均提供(1 072±815)种非处方药,其中化学药品(259±165)种、中成药(813±650)种,供应药品品种数排前3位的依次为健客网(3 658种)、健一网(2 071种)、康爱多(1 523种)。共发放调查问卷216份,回收有效问卷183份,有效回收率为84.7%。183位受访市民对于辨别网上药店真伪(75.4%)和药品真伪(67.1%)的认知度较高,但对于网上药店开办资质、网络售药相关规定等的认知度较差;仅22.4%有过网络购药经历,且对网络购药满意度从高到低依次为药品价格(62.5%)、药师专业咨询(50.0%)、药品品种数(45.0%)、药品质量(37.5%)、物流速度(35.0%)等;如有网络购药可能,主要需求是补充矿物质和微量元素的药品(63.9%)和常见病用药(40.4%)。结论:当前上海市民对于网络购药需求尚不强烈,对于网络购药信心不足,尽管处方药网上零售权放开可能会刺激互联网药品交易,但目前条件尚不成熟。建议应当以可控的方式放开处方药销售,推进网络购药医保结算,多方位促进互联网药品交易服务有序发展。

关键词：互联网药品交易网上药店零售认知态度行为调查

用Chiralpak AD-H手性色谱柱HPLC法拆分阿罗洛尔对映体

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药学服务与研究 2015年第5期15卷 351-353页

作者：裘戈彬郑乐艺吕权真张劲柏闻俊洪战英第二军医大学药学院药物分析学教研室上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室解放军73235部队

目的:建立拆分阿罗洛尔手性对映体的手性固定相HPLC法。方法:采用纤维素直链淀粉类手性固定相Chiralpak AD-H色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),考察了流动相比例、流速、碱性添加剂等因素对阿罗洛尔手性对映体拆分效果的影响。结果:确定了最... 详细信息

目的:建立拆分阿罗洛尔手性对映体的手性固定相HPLC法。方法:采用纤维素直链淀粉类手性固定相Chiralpak AD-H色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),考察了流动相比例、流速、碱性添加剂等因素对阿罗洛尔手性对映体拆分效果的影响。结果:确定了最佳拆分条件:流动相为正己烷-乙醇-二乙胺-三乙胺=30∶70∶0.1∶0.1(V/V),流速为0.4ml/min,检测波长为315nm,柱温为25℃,阿罗洛尔对映体拆分的分离度为3.033,对映体能够得到良好的拆分。结论:该法操作简便,可用于阿罗洛尔对映体的分离及质量控制。

关键词：阿罗洛尔手性拆分淀粉类手性固定相色谱法高效液相

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中国互联网药品零售情况调查

中国互联网药品零售情况调查

基于GEE和地理探测器的河南省不同流域植被变化及影响因素

2015年中国药学会药事管理专业委员会年会暨“推进法治建设，依法管理药品”学术研讨会

作者：徐富张劲柏郑乐艺李萧舒丽芯第二军医大学药学院药学队第二军医大学药学院药事管理与临床药学教研室

目的:调查研究中国互联网药品零售药房的规模、规范性以及公众的认知度、需求意向等现况,分析问题,提出建议。方法:应用文献调研法、现况调查法、现场问卷法等方法。结果:截至2015年6月12日,取得《互联网药品交易服务许可证》的零售连... 详细信息

目的:调查研究中国互联网药品零售药房的规模、规范性以及公众的认知度、需求意向等现况,分析问题,提出建议。方法:应用文献调研法、现况调查法、现场问卷法等方法。结果:截至2015年6月12日,取得《互联网药品交易服务许可证》的零售连锁药店(以下简称网上药店)共307家,仅有62家(20.2%)完全符合规定;2014年网上销售额前19位网络药店中,平均提供1072±815种非处方药,其中化学药品259±165种,中成药813±650种;抽样调查的183位上海市市民中,仅41位(22.4%)有过网络购药经历,对互联网药品交易满意度依次为药品价格(62.5%)、药师专业咨询(50.0%)、品种数量(45.0%)、药品质量(37.5%)、物流速度(35.0%)等。如有网络购药可能,市民的主要需求是补充矿物质和微量元素的药品(63.9%)、常见病用药(40.4%)。市民对如何核实网络药店资质(75.4%)和药品真伪(67.1%)认知度较高,但对网络药店对开办资质、售药范围认知度较差。结论:互联网药品交易服务违规情况较为严重,公众对网络购药信心不足,对相关规定认知度堪忧。应当采取有效措施促进互联网药品交易服务有序发展。

关键词：互联网药品交易网上药店

来源： cnki会议评论

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应用生态学报 2024年第7期35卷 1887-1896页

作者：李霞张乐艺吴晨长安大学土地工程学院西安710064 长安大学水利与环境学院西安710064 长安大学旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室西安710064 长安大学水利部旱区生态水文与水安全重点实验室西安710064 西安市土地科学与工程国际科技合作基地西安710064 河南理工大学测绘与国土信息工程学院河南焦作454000

厘清植被变化及驱动因素,可为生态修复和社会可持续发展提供参考。本研究基于Google Earth Engine平台获取2000—2020年河南省植被覆盖数据,并结合Theil-Sen Median趋势、Mann-Kendall检验和Hurst指数,揭示河南省及其流域分区(海河流域... 详细信息

厘清植被变化及驱动因素,可为生态修复和社会可持续发展提供参考。本研究基于Google Earth Engine平台获取2000—2020年河南省植被覆盖数据,并结合Theil-Sen Median趋势、Mann-Kendall检验和Hurst指数,揭示河南省及其流域分区(海河流域分区、黄河流域分区、淮河流域分区、长江流域分区)植被分布和变化趋势,并联合因子探测及因子交互,从不同尺度探究了自然和人文因素对植被的影响机制。结果表明:研究期间,河南省植被覆盖度(FVC)呈南高北低的分布格局,以中高植被覆盖为主,其中,长江流域分区最好。河南省及各分区FVC变化规律一致,呈波动上升趋势,均以明显改善为主,其中,长江流域分区的改善面积最大。基于Hurst指数,河南省未来植被状况除了淮河流域分区可能持续改善外,其他分区均表现为从改善转向退化。河南省及各分区植被变化是人文因子与自然因子综合作用的结果,因子影响力随时间而改变,主导因子存在地域差异,土地利用/覆盖类型和夜间灯光等人文因素的影响强于海拔、坡度、年均低温等自然因素。因素间的交互作用,尤其是人文与自然因素的交互作用,呈非线性增强关系。

关键词：植被覆盖度谷歌地球引擎因子探测因子交互河南省

面向自动驾驶场景的道路缺陷检测与风险评估研究

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面向自动驾驶场景的道路缺陷检测与风险评估研究

作者：袁乐艺广西大学

学位级别：硕士

《可持续粮食经济学：针对健康与环境的优选政策》（第二章至第三章）英汉翻译实践报告

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《可持续粮食经济学：针对健康与环境的优选政策》（第二章至第三...

作者：郑乐婷河南农业大学

学位级别：硕士

中国作为农业人口大国,粮食问题一直是国家工作的重心之一。然而,我国当前的农业食品体系仍存在诸多问题。为了解决这些问题,对当前的农业食品体系进行改革势在必行。在此背景下,知名经济学家Nicoletta Batini的《可持续粮食经济学:针... 详细信息

中国作为农业人口大国,粮食问题一直是国家工作的重心之一。然而,我国当前的农业食品体系仍存在诸多问题。为了解决这些问题,对当前的农业食品体系进行改革势在必行。在此背景下,知名经济学家Nicoletta Batini的《可持续粮食经济学:针对健康与环境的优选政策》(The Economics of Sustainable Food:Smart Policies for Health and the Planet)对于解决上述问题有一定的建设性意义。因此,译者选取该书的第二章和第三章作为本次翻译实践报告的源文本。这两章分别阐述了发达经济体和欠发达经济体目前的食品供应体系对人体健康、生态环境等方面造成的破坏,并提出了有效的解决方法。译者以功能对等理论为指导,从词汇和句子两个层面阐释了翻译过程中遇到的难点以及解决方法。为了使译文用词精确,语句通顺,内容忠实源文本,译者采用了许多翻译方法。在词汇层面,译者采用了选词法、转换法和增译法。在句子层面,译者采用了合译法、分译法、省译法、重组法和语态转换法。通过此次翻译实践,译者不仅提高了自身的翻译能力,进一步掌握了功能对等理论,还对农业食品产业相关知识有了一定的了解。译者也希望本报告能为我国农业食品体系改革提供一定参考。

关键词：《可持续粮食经济学:针对健康与环境的优选政策》翻译实践报告功能对等

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让核心素养可见的表现性试题命制

思想政治课教学 2024年第6期6卷 83-86页

作者：郑乐安浙江省宁波市教育局教研室

表现性评价能够让素养可测可评,表现性试题是基于表现性评价理念的开放性试题,具有现实的价值意蕴。以2023年浙江省宁波市初中学业水平考试社会·法治试题卷第25题为例,从嵌入式的素养目标、交互式的动态任务、结构化的学科知识、沉浸... 详细信息

表现性评价能够让素养可测可评,表现性试题是基于表现性评价理念的开放性试题,具有现实的价值意蕴。以2023年浙江省宁波市初中学业水平考试社会·法治试题卷第25题为例,从嵌入式的素养目标、交互式的动态任务、结构化的学科知识、沉浸式的真实情境、阶梯式的评价画像五个方面探索集试题立意、任务指向、知识建构、情境设置、评分标准于一体的命题新路径,以此突破传统单量度试题评价机制,使其对核心素养的考查具体化、层次化、可视化。

关键词：表现性命题核心素养命制策略学业水平考试