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桃儿七苯丙氨酸解氨酶的基因克隆及其酶活分析

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生物工程学报 2023年第7期39卷 2818-2838页

作者：胡迪罗晓伟王宇贤龚明邹竹荣云南师范大学生命科学学院教育部生物质能源持续发展和应用工程研究中心云南昆明650500

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)作为植物苯丙烷类途径的入口关键酶,对抗肿瘤木脂素——鬼臼毒素的生物合成具有重要影响。桃儿七[Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying]是鬼臼毒素的主要天然来源,以四川阿坝地区桃... 详细信息

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)作为植物苯丙烷类途径的入口关键酶,对抗肿瘤木脂素——鬼臼毒素的生物合成具有重要影响。桃儿七[Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying]是鬼臼毒素的主要天然来源,以四川阿坝地区桃儿七植株的根为材料,基于桃儿七公共SRA转录组数据包,通过反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)克隆其苯丙氨酸解氨酶基因ShPAL。生物信息学分析表明,ShPAL编码蛋白由711个氨基酸组成,包含PAL保守结构域,有芳香族氨基酸解氨酶活性中心的特征性基序,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,单体三级结构呈现典型的“海马状”,Swiss建模空间结构为同源四聚体,在系统发育谱系上与同属小蘖科(Berberidaceae)的三枝九叶草(Epimedium sagittatum)PAL序列相似度最高、进化距离最短。亚细胞定位实验结果显示ShPAL蛋白主要定位于细胞质中、少量定位于内质网膜上。ShPAL蛋白通过大肠杆菌(Escherichia coli)重组表达和组氨酸标签亲和纯化,其酶活高达20.91 U/mg,最适温度为41℃,最适pH为9.0;其F130H突变体酶活降低约23.6%,但随温度、pH变化的趋势不变,证实该位置的苯丙氨酸确为影响PAL底物特异性的残基;两者的热稳定性均较差,但pH稳定性较好。这些结果将有助于进一步分析ShPAL在鬼臼毒素生物合成过程中的调控作用,以及促进鬼臼毒素异源合成,从而保护桃儿七种质资源,同时也表明ShPAL可在生物化工和生物医学方面具有潜在应用价值。

关键词：桃儿七苯丙氨酸解氨酶基因克隆生物信息学分析酶活分析

小桐子非特异性脂质转移蛋白A的基因克隆及其表达和功能分析

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植物生理学报 2015年第1期51卷 127-135页

作者：王海波邹竹荣龚明云南师范大学生命科学学院生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室昆明650500 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院云南曲靖655011

基于我们最近获得的小桐子低温驯化转录组和数字基因表达谱数据,本工作研究了低温驯化条件下差异表达变化较大的非特异性脂质转移蛋白A基因Jcns LTPA。克隆到该基因的c DNA序列全长833 bp,开放阅读框长度513 bp,编码170个氨基酸,存在ATT... 详细信息

基于我们最近获得的小桐子低温驯化转录组和数字基因表达谱数据,本工作研究了低温驯化条件下差异表达变化较大的非特异性脂质转移蛋白A基因Jcns LTPA。克隆到该基因的c DNA序列全长833 bp,开放阅读框长度513 bp,编码170个氨基酸,存在ATT_LTSS典型保守功能基序。其启动子区域中鉴定到了TATA框、CAAT框、CATA框、W框等顺式作用元件以及CRT/DRE低温响应元件。半定量RT-PCR分析表明,该基因在茎、根、叶中都有表达,以茎中表达量最高、且受低温诱导最显著。同时,酵母表达Jcns LTPA也提高了重组酵母菌的抗低温能力。这些结果充分说明了小桐子Jcns LTPA是与抗冷性密切相关的基因,可以用于小桐子的抗冷性遗传改良。

关键词：小桐子非特异性脂质转移蛋白A 基因克隆酵母表达

小桐子低温诱导查耳酮合酶基因的克隆及其表达分析

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热带亚热带植物学报 2015年第4期23卷 370-378页

为了解查耳酮合酶在小桐子(Jatropha curcas)抗冷性形成中的作用,基于小桐子低温锻炼转录组和数字基因表达谱数据,克隆了低温新诱导表达的小桐子查耳酮合酶基因(Jc CHS),并分析了该基因的表达特性和功能。结果表明,Jc CHS基因的c DNA全... 详细信息

为了解查耳酮合酶在小桐子(Jatropha curcas)抗冷性形成中的作用,基于小桐子低温锻炼转录组和数字基因表达谱数据,克隆了低温新诱导表达的小桐子查耳酮合酶基因(Jc CHS),并分析了该基因的表达特性和功能。结果表明,Jc CHS基因的c DNA全长为1386 bp,包含完整开放阅读框(ORF)1170 bp,编码389个氨基酸,Jc CHS的理论分子量为42.2 k Da、等电点为6.53,与蓖麻CHS蛋白序列的相似性高达93.6%,具有III型聚酮合酶家族保守的查耳酮合酶/对苯乙烯合酶结构域。半定量RTPCR分析表明,Jc CHS在小桐子各组织中都有表达,其中根的表达量较高。Jc CHS基因的表达能在一定程度上提高重组酵母菌的低温抵抗能力,这说明Jc CHS基因可能参与了小桐子的抗低温响应。

关键词：小桐子查耳酮合酶低温诱导表达基因克隆酵母

小桐子转录因子CBF基因的克隆及酵母表达载体的构建

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植物生理学报 2015年第7期51卷 1157-1166页

作者：王海波王莎莎邹竹荣龚明云南师范大学生命科学学院生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室昆明650500 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院云南曲靖655011

高等植物不依赖ABA的低温信号转导途径中,存在于细胞膜上的低温感受器通过ICE-CBF-COR级联响应将外界低温信号传导至胞内,CBF转录因子是承接上游ICE类转录激活因子与下游COR类低温响应基因的关键环节。本文利用前期获得的小桐子低温锻... 详细信息

高等植物不依赖ABA的低温信号转导途径中,存在于细胞膜上的低温感受器通过ICE-CBF-COR级联响应将外界低温信号传导至胞内,CBF转录因子是承接上游ICE类转录激活因子与下游COR类低温响应基因的关键环节。本文利用前期获得的小桐子低温锻炼转录组数据,克隆到了一条小桐子CBF基因的c DNA序列,命名为Jc CBF1(Gen Bank登录号KJ670147.1)。结果表明,该c DNA序列全长1 034 bp,完整开放阅读框729 bp,编码242个氨基酸,分子量为26.6 k Da,理论等电点为9.38,具有CBF家族典型的AP2基序,同时构建了其酵母表达载体,为小桐子CBF转基因功能验证奠定基础。

关键词：小桐子转录因子 CBF 不依赖ABA的低温信号转导基因克隆表达载体构建

小桐子赤霉素20氧化酶的基因克隆及低温下表达分析

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生物技术通报 2015年第10期31卷 140-148页

作者：王海波邹竹荣龚明云南师范大学生命科学学院生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室昆明650500 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院曲靖655011

赤霉素20氧化酶是植物赤霉素生物合成的限速酶,决定有生物活性的GA1与GA4的合成量。基于先前获得的小桐子低温锻炼转录组数据,以小桐子幼苗的根为材料,采用RT-PCR技术克隆到小桐子赤霉素20氧化酶基因Jc GA20ox的c DNA序列(Gen Bank登录... 详细信息

赤霉素20氧化酶是植物赤霉素生物合成的限速酶,决定有生物活性的GA1与GA4的合成量。基于先前获得的小桐子低温锻炼转录组数据,以小桐子幼苗的根为材料,采用RT-PCR技术克隆到小桐子赤霉素20氧化酶基因Jc GA20ox的c DNA序列(Gen Bank登录号KJ670150.1)。该c DNA全长1 307 bp,含有完整的开放阅读框(1 131 bp),编码376个氨基酸,分子量为43 k D,理论等电点为6.7。其推导蛋白属于2-ODD家族,包含2-酮戊二酸双加氧酶结构域(Fe2OG_OXY)。半定量RT-PCR表达分析显示,Jc GA20ox在小桐子各组织中都有表达,但表达水平具有组织特异性,在茎中表达量较高,且受低温诱导表达最显著,而在叶中表达量相对较低。

关键词：小桐子赤霉素20氧化酶 2-酮戌二酸双加氧酶结构域低温诱导

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高含硫蛋白基因及其在植物品质改良中的应用

生物学通报 1997年第3期32卷 10-12页

作者：邹竹荣俞梅敏中国农业科学院生物技术研究中心北京100081

概述了目前对植物高合硫蛋白、基因的初步认识和它们在植物生长发育过程中所起的作用，以及在植物品质改良中的应用。

关键词：高含硫蛋白基因植物品质改良品质育种

水稻10kD醇溶蛋白基因表达双元质粒的构建及其对烟草的遗传转化

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农业生物技术学报 1996年第1期4卷 28-32页

作者：邹竹荣俞梅敏中国农业科学院生物技术研究中心北京大学生命科学院北京 100081 北京 100871

将高含硫水稻10 kD 醇溶蛋白基因从质粒 pFM18亚克隆到植物高效表达载体卡盒pRS100中,得到双元表达质粒 pRS10K;对其进行 PCR 扩增及 PCR 产物酶切分析,表明pRS10K 包含来自 pRS100的 rbcS 高效表达启动子、终止子和 M13通用引物互补序... 详细信息

将高含硫水稻10 kD 醇溶蛋白基因从质粒 pFM18亚克隆到植物高效表达载体卡盒pRS100中,得到双元表达质粒 pRS10K;对其进行 PCR 扩增及 PCR 产物酶切分析,表明pRS10K 包含来自 pRS100的 rbcS 高效表达启动子、终止子和 M13通用引物互补序列及水稻10 kD 醇溶蛋白基因。将 pRS10K 通过农杆菌感染法转化烟草,并对烟草转化植株进行 PCR 检测和 Southern 杂交,结果证明 pRS10K 的 RB-LB 间的 DNA 片段已经整入到烟草基因组中,同时,GUS 染色也表明 GUS 在转基因烟草中获得正常表达,因而质粒 pRS10K 可以进一步用做其它高等植物如豆科牧草的遗传转化。

关键词：水稻10 kD 醇溶蛋白基因表达双元质粒遗传转化 GUS 染色

基于RNA-Seq数据筛选的小桐子抗冷相关基因的表达模式及其聚类分析

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基因组学与应用生物学 2014年第6期33卷 1196-1205页

作者：王海波邹竹荣龚明云南师范大学生命科学学院生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室昆明650500 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院曲靖655011 云南师范大学生命科学学院生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室昆明650500

能源树种小桐子属冷敏植物,受低温胁迫影响涉及到形态、生理、生化、基因表达及调控等多个方面。我们最近通过RNA-Seq技术获得了小桐子低温锻炼转录组(45 251条Unigene)及其数字基因表达谱数据,发现在12℃低温锻炼下有4 185个基因表达... 详细信息

能源树种小桐子属冷敏植物,受低温胁迫影响涉及到形态、生理、生化、基因表达及调控等多个方面。我们最近通过RNA-Seq技术获得了小桐子低温锻炼转录组(45 251条Unigene)及其数字基因表达谱数据,发现在12℃低温锻炼下有4 185个基因表达量发生变化,其中在不同锻炼时间(12 h,24 h,48 h)内都发生变化的基因有553个。本工作从中选择了22个与对照相比有较大表达差异、新诱导的或被公认的抗冷相关基因,通过半定量RT-PCR及进一步聚类分析检测它们在小桐子不同组织及低温锻炼过程中的表达模式,结合其数字基因表达结果以期找出与小桐子抗冷性密切相关的潜在关键基因,为小桐子抗冷性的遗传改良打下基础。

关键词：小桐子 RNA-Seq 抗冷相关基因表达模式聚类分析

小桐子甲硫氨酸亚砜还原酶A的基因克隆及生物信息学分析

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基因组学与应用生物学 2015年第4期34卷 821-829页

逆境胁迫下产生的过量活性氧会导致蛋白质分子中甲硫氨酸(Met)被氧化成甲硫氨酸亚砜(Met SO),甲硫氨酸亚砜还原酶(MSR)则可以还原亚砜结构而恢复受损伤蛋白质的活性,以抵抗逆境造成的各种氧化胁迫。基于本课题组先前获得的小桐子低温锻... 详细信息

逆境胁迫下产生的过量活性氧会导致蛋白质分子中甲硫氨酸(Met)被氧化成甲硫氨酸亚砜(Met SO),甲硫氨酸亚砜还原酶(MSR)则可以还原亚砜结构而恢复受损伤蛋白质的活性,以抵抗逆境造成的各种氧化胁迫。基于本课题组先前获得的小桐子低温锻炼转录组数据,筛选到小桐子甲硫氨酸亚砜还原酶A基因,并克隆到该基因的全长c DNA,命名为Jc MSRA(Gen Bank登录号:KJ670154.1)。结果表明,该c DNA序列全长879 bp,完整开放阅读框780 bp,编码259个氨基酸,理论分子量为29.1 k D,等电点为8.75。Jc MSRA蛋白具有GCFW保守序列及C端保守Cys残基。聚类分析表明,Jc MSRA属于A型MSR家族,与芸豆的亲缘关系最近,序列同源性达到70.3%。

关键词：小桐子甲硫氨酸亚砜还原酶基因克隆生物信息学分析