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作者：邵泽香山东农业大学

学位级别：硕士

鸭病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis, DVH)又称鸭肝炎,是由鸭病毒性肝炎病毒(Duck Hepatitis virus, DHV)引起的一种急性、高度致死性的传染病,以肝炎为主要特征,主要发生于三周龄以下雏鸭。近年来该病的发病率和死亡率不断上升,严重危... 详细信息

鸭病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis, DVH)又称鸭肝炎,是由鸭病毒性肝炎病毒(Duck Hepatitis virus, DHV)引起的一种急性、高度致死性的传染病,以肝炎为主要特征,主要发生于三周龄以下雏鸭。近年来该病的发病率和死亡率不断上升,严重危害了养鸭业的健康发展。鸭肝炎病毒有三个血清型,分别引起I型、II型和III型鸭肝炎,其中I型和III型属于小RNA病毒科,II型属于星状病毒科。国内外主要流行I型鸭肝炎。本研究利用3′RACE方法扩增并克隆了4株鸭肝炎病毒(DHV)(ZYM株、Z05株、Z07株和Z10株)的基因组的3′末端真实序列,包括部分非结构蛋白(3D)基因以及紧接着3D基因下游的3′端非编码区(untranslated region,UTR)和poly(A)尾巴。测序结果表明,扩增的特异性片段长度为597 nt(不包括polyA尾巴)。各毒株3′UTR均为314 nt,位于终止密码子TGA之后,比对分析结果表明各毒株间的同源性较高;4株DHV3′末端核苷酸序列(不包括polyA尾巴)之间的同源性为96.3 %～100 %,而与参考毒株之间的同源性为93.5 %～99.7 %。在系统发生进化树上,各毒株亲缘关系较近。根据己发表的I型鸭病毒性肝炎病毒(Duck virual hepatitis virus type I, DHV-I)的基因组序列,设计并合成了覆盖DHV-I全基因组序列的8对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增得到了DHV-I Z10株基因组的各片段,其中病毒基因组3′末端序列的扩增是通过RACE方法得到。将扩增产物分别克隆于pMD-18T载体中进行测序,测序结果拼接后,进行BLAST在线同源搜索,确定为I型鸭肝炎病毒基因组序列,并利用分子生物学软件对Z10株序列组成,以及DHV的分子演化关系等进行辅助分析。序列分析表明Z10株全基因组由7688个核苷酸组成,基因组中只含有一个大的阅读框架(ORF),编码2249个氨基酸,多聚蛋白裂解位点比较保守,最终形成12个成熟的蛋白,依次为VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A -3B-3C-3D。对Z10株全基因组序列与GenBank上发表的6株DHV基因组全序列进行比对,比对结果表明,Z10株与DHV-I CL株亲缘关系最近,核苷酸序列一致性为98.4 %;与H株核苷酸序列同源性最低,为95.3 %。与03D株序列比对显示,Z10株没有发生碱基插入或缺失;且在其基因组5'端有一个长达626 nt的非编码区(NCR),3'NCR含有314个核苷酸(不包括poly(A)尾巴)。根据GenBank中已登录的DHV VP1基因的序列设计1对引物,采用RT-PCR方法成功地扩增出4株I型鸭肝炎病毒(DHV) (分别命名Z05、Z06、Z07、Z10)的VP1全基因的cDNA片段,将4个cDNA片段分别克隆到pMD18-T Vector载体中进行序列测定,得到4个毒株VP1基因的序列。应用分子生物学软件分析其与目前GenBank上发表的具有代表性的DHV-I VP1基因的遗传变异,分析结果表明4株I型鸭肝炎毒株VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸。经比对分析得知4株DHV-I之间VP1基因的核苷酸序列相似性93.0 %～99.7 %,氨基酸序列相似性为95.4 %～100 %;与参考毒株的VP1基因的核苷酸序列相似性91.2 %～99.7 %,氨基酸序列相似性为94.5 %～98.7 %,各毒株的亲缘关系较近。根据VP1的氨基酸序列,绘制了不同DHV-I分离株的系统进化树。结果显示,其中3株浙江分离株属于同一基因群,VP1氨基酸变异主要表现为羧基端出现多处氨基酸置换,提示VP1可能含有DHV-I的毒力相关的位点。本试验从基因水平上研究病毒的进化情况,揭示与其他毒株的亲源关系,分析其基因型,为该病在流行病学和预防控制方面的研究奠定基础。根据已知的基因组序列,设计、合成了1对能快速检测DHV-I的特异性引物,并建立了DHV-I的RT-PCR检测方法。与传统的DHV-I检测方法相比,该方法具有快速、敏感和高度特异性等技术优势,可应用于DHV-I的流行病学调查和临床诊断等。

关键词： DHV-I RT-PCR VP1 3′RACE 序列比对分析

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地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶基因的克隆表达及其分子改造

地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶基因的克隆表达及其分子改造

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作者：邵泽香南京农业大学

学位级别：硕士

L-天冬酰胺酶可将L-天冬酰胺侧链的酰胺基水解成天冬氨酸和氨,且在微生物中广泛存在。研究发现L-天冬酰胺酶可以减少热加工食品中致癌物——丙烯酰胺的形成,同时,对生产工艺、产品外观、风味以及营养等方面没有任何影响。此外,L-天冬酰... 详细信息

L-天冬酰胺酶可将L-天冬酰胺侧链的酰胺基水解成天冬氨酸和氨,且在微生物中广泛存在。研究发现L-天冬酰胺酶可以减少热加工食品中致癌物——丙烯酰胺的形成,同时,对生产工艺、产品外观、风味以及营养等方面没有任何影响。此外,L-天冬酰胺酶也能够用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤等疾病。但天然L-天冬酰胺酶的低催化活力、低热稳定性等缺陷一直限制着其在食品安全和医疗中的广泛应用。因此,寻找具有优良性质的L-天冬酰胺酶具有深远意义。本文主要针对以上问题,首先对地衣芽孢杆菌来源的L-天冬酰胺酶基因进行了克隆和异源表达,其次对重组酶进行酶学性质初步研究,最后对L-天冬酰胺酶基因进行分子改造,包括定向进化和半理性设计,并对突变酶进行了酶学性质的初步研究。旨在为L-天冬酰胺酶在食品工业化生产中的应用奠定基础。本研究结果分述如下。1.地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶基因的克隆表达。根据Genbank中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheiforiis)的全基因组序列成功克隆出L-天冬酰胺酶基因ansZ(1131),其编码376个氨基酸,理论分子量为40kDa左右。构建重组表达载体pET-30a-Bli-ansZ,实现L-天冬酰胺酶基因ansZ在Escherichia coli中异源表达,重组酶酶活为3.97±0.16 IU/mL。纯化后重组酶酶学性质研究表明,其比活为148.83 IU/mg;最适催化反应条件为pH8.0,40℃;在pH5.0到pH10.0环境下表现出高于70%以上的残余酶活;50℃处理8 h后仍保留80%以上残余酶活;动力学参数米氏常数Km为0.692 mM,最大反应速度Vmax为1.68IU/μg。表明该重组酶其具有相对较宽的pH适应活性范围和较好的热稳定性,利于其在食品加工中的应用。2.地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的定向进化.易错PCR反应体系为dCTP、dTTP各0.2mM,Mn2+浓度0.05mM、Mg2+浓度3/5/7mM。经3轮易错PCR,从12600多个突变株中筛选出酶活最高的突变体F5A11,其酶活为8.961±0.225 IU/mL,是野生型酶酶活的2.26倍。以易错PCR筛选得到的酶活最高的前四株突变体作为亲本进行DNA Shuffling,从6500个突变文库中筛选到三株酶活提高的突变体S10、S16和S21。酶学性质研究表明,最优突变体S10,其酶活为12.648±0.351 IU/mL,是野生型酶酶活的3.19倍,纯化后比活达到306.589 IU/mg,较野生型酶比活提高106%,同时突变酶S10的Km值低于野生型酶,Kcat/Km值高于野生型酶,说明突变体酶对底物的亲和力有所增强,催化效率有所提高。三维建模分析和圆二色谱结果表明,43位突变氨基酸可能造成底物和催化中心氢键相互作用增强,67位突变氨基酸可能导致突变酶柔性增加,有利于酶与底物结合和产物的释放,进而提高酶的底物亲和力和转化效率,这可能是突变酶酶活和催化效率提高的主要原因。表明利用定向进化策略能够有效地提高地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶活性。3.地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的半理性设计。以突变体S10质粒为模板,在43位和67位分别进行饱和突变,建立突变文库,筛选后获得突变酶活力进一步提高的突变体K43Y/N67S和K43E/N67A,并通过两点组合突变技术将K43Y/N67S和K43E/N67A两个突变体组合,获得突变体K43Y/N67A。对突变体K43Y/N67S、K43E/N67A和K43Y/N67A进行酶学性质研究,结果表明,最优突变酶K43Y/N67S酶活为14.45±0.37 IU/ml,是野生型酶活的3.64倍;50℃热处理下,突变酶K43Y/N67S半衰期延长3 h。三维建模分析和圆二色谱结果表明,突变酶K43Y/N67S二级结构中α-螺旋数有所上升,突变后苯环结构的增加和疏水性作用增强可能对蛋白构象起到稳定性作用,单聚体界面柔性的增大可能有利于酶催化活性的提高。半理性设计提高了地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的酶活,热稳定性也有所改善。

关键词： L-天冬酰胺酶 Bacillus licheniformis 克隆表达定向进化半理性设计

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行政事业单位会计基础工作规范化建设现状研究——以F县行政事业单位调研为例

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齐鲁珠坛 2024年第5期 1-5页

作者：姜毅邵泽香临沂市公路事业发展中心费县中心费县财政局

一、研究背景及意义(一)研究背景2019年3月14日,财政部对《会计基础工作规范》进行了修订,旨在加强行政事业单位会计基础工作规范化建设,切实发挥财会监督职能作用,规范会计工作秩序,提高会计信息质量。2022年4月,山东省财政厅组织开展... 详细信息

一、研究背景及意义(一)研究背景2019年3月14日,财政部对《会计基础工作规范》进行了修订,旨在加强行政事业单位会计基础工作规范化建设,切实发挥财会监督职能作用,规范会计工作秩序,提高会计信息质量。2022年4月,山东省财政厅组织开展全省行政事业单位“会计基础工作规范年”活动,以习近平新时代中国特色社会主义思想为指导,将实现全省行政事业单位会计基础工作规范化运行作为目标,推动会计工作转型升级,着力加强会计基础工作规范化建设,积极构建合法、科学、完善、高效的会计工作新秩序。

关键词：行政事业单位会计会计工作秩序习近平新时代中国特色社会主义思想山东省财政厅基础工作规范化会计基础工作规范转型升级提高会计信息质量

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Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

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浙江农业学报 2009年第5期21卷 434-438页

作者：邵泽香韦强鲍国连崔言顺刘燕季权安浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021 山东农业大学动物科技学院山东泰安271018

参考GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)的基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了一对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的RT-PCR检测方法。以该方法对实验室分离并保存的DHV强毒株Z10株的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到了预期大小... 详细信息

参考GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)的基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了一对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的RT-PCR检测方法。以该方法对实验室分离并保存的DHV强毒株Z10株的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到了预期大小为699 bp的目的片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果与GenBank中的DHV-Ⅰ的相应基因序列比对分析,同源性均达90%以上,表明为DHV-Ⅰ的基因序列,对NDV,IBDV,DPV和GPV等常见病毒扩增结果为阴性。该方法敏感性检测结果表明,最低RNA模板检出量为24 pg。表明所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于I型鸭病毒性肝炎病毒的快速诊断。

关键词： Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ) RT-PCR 检测

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财政局加强会计预算管理的有效措施

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中国乡镇企业会计 2017年第6期 64-65页

作者：邵泽香颜佩芳费县财政局费县林业局

随着我国市场经济的不断发展，新的经济类型层出不穷。为财政局带来了新的挑战的同时也提醒着财政局应该首先抓紧财务预算。本文将从如何在财政局现存的问题上找出加强会计预算管理有效措施进行具体分析。

关键词：财政局会计预算管理措施

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基于定向进化技术提高地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶活性

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食品科学 2017年第22期38卷 8-13页

作者：邵泽香焦琳舒陆兆新别小妹赵海珍张充吕凤霞南京农业大学食品科技学院江苏南京210095

为提高地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶活性,通过定向进化技术对其进行分子改造。经过两轮易错聚合酶链式反应和一轮DNA shuffling,从19 100多个突变株中筛选到突变体S10、S16和S21,其酶比活力较野生型分别提高了106%、74%和43%,且突变酶K_(ca... 详细信息

为提高地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶活性,通过定向进化技术对其进行分子改造。经过两轮易错聚合酶链式反应和一轮DNA shuffling,从19 100多个突变株中筛选到突变体S10、S16和S21,其酶比活力较野生型分别提高了106%、74%和43%,且突变酶K_(cat)/K_m都有所增大。其中,突变体S10氨基酸序列发生3个突变,K43E、N67S和I269L。三维模拟结果显示,第43位氨基酸突变为谷氨酸、第67位氨基酸突变为丝氨酸,可能提高了底物亲和力和催化效率,从而提高酶活性。圆二色谱分析表明,相比野生酶,突变酶的α-螺旋数减少、无规则卷曲有所增加,表明其刚性略有降低,柔性有所增加。利用定向进化策略能够有效地提高地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶活性。

关键词： L-天冬酰胺酶定向进化酶活性

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基于定向进化技术提高巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶活性

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食品科学 2018年第18期39卷 179-185页

作者：赵云飞邵泽香陆兆新别小妹赵海珍张充吕凤霞南京农业大学食品科学技术学院江苏南京210095

为提高巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶活性,通过定向进化技术对其进行酶工程改造。经过二轮易错聚合酶链式反应,从13 000多个突变株中筛选到突变株A5-3、E2-4、E3-11,相对于野生型,其酶比活力提高了157%、115%、97%,且K_(cat)/K_m都有所增大... 详细信息

为提高巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶活性,通过定向进化技术对其进行酶工程改造。经过二轮易错聚合酶链式反应,从13 000多个突变株中筛选到突变株A5-3、E2-4、E3-11,相对于野生型,其酶比活力提高了157%、115%、97%,且K_(cat)/K_m都有所增大。其中A5-3氨基酸序列发生了2个突变(A55D和D451E)。三维模拟结果表明,第55位丙氨酸突变为天冬氨酸很可能为酶促反应提供H^+,从而加快酶促反应效率;突变株E2-4第34位由亮氨酸突变成谷氨酰胺,一定程度上改善了酶的热稳定性;突变株E3-11的第325位由丙氨酸突变成丝氨酸有利于蛋白内部形成更多氢键,增大了该部位的柔性,更有利于氨基酸残基之间发生相互作用。圆二色谱分析表明,突变株与野生型具有相似的三维结构,相比于野生酶,突变酶的α-螺旋减少,无规则卷曲增加,说明突变酶刚性有所下降而柔性增加。利用定向进化技术可以明显改善谷氨酸脱羧酶的酶活性,为其工业化的应用提供实验参考。

关键词：谷氨酸脱羧酶定向进化酶活性

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Race法扩增4株鸭肝炎病毒3′末端序列及其克隆分析

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浙江农业学报 2009年第3期21卷 225-229页

作者：邵泽香韦强崔言顺鲍国连刘燕季权安山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021

利用3’RACE方法扩增并克隆了4株鸭肝炎病毒（DHV）（ZYM株、Z05株、Z07株和Z10株）的基因组的3’末端真实序列，包括部分非结构蛋白（3D）基因以及紧接着3D基因下游的3’端非编码区（untranslated region，UTR）和poly（A）尾巴。测序... 详细信息

利用3’RACE方法扩增并克隆了4株鸭肝炎病毒（DHV）（ZYM株、Z05株、Z07株和Z10株）的基因组的3’末端真实序列，包括部分非结构蛋白（3D）基因以及紧接着3D基因下游的3’端非编码区（untranslated region，UTR）和poly（A）尾巴。测序结果表明，扩增的特异性片段长度为597nt（不包括polyA尾巴）。各毒株3’UTR均为315nt，位于终止密码子TGA之后，比对分析结果表明各毒株间的同源性较高；4株DHV 3’末端核苷酸序列（不包括polyA尾巴）之间的同源性为96．3％～100％，而与参考毒株之间的同源性为93．5％～99．7％。在系统发生进化树上，各毒株亲缘关系较近。

关键词： 3’RACE 鸭病毒性肝炎病毒序列比对分析 3’端非编码区 Poly(A)

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鸭疫里默氏杆菌原生质体制备与再生的研究

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浙江农业学报 2009年第4期21卷 311-315页

作者：王春平韦强崔言顺鲍国连刘燕邵泽香山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021

以耐药标记的鸭疫里默氏杆菌TXRA1(Chlr,Erys)为亲本菌株,在DNase I始终存在的条件下,采用Lysozyme-EDTA法制备原生质体,然后在高渗琼脂平板上再生。系统地优化了影响原生质体制备及再生的各种条件,摸索出鸭疫里默氏杆菌TXRA1以Lysozyme... 详细信息

以耐药标记的鸭疫里默氏杆菌TXRA1(Chlr,Erys)为亲本菌株,在DNase I始终存在的条件下,采用Lysozyme-EDTA法制备原生质体,然后在高渗琼脂平板上再生。系统地优化了影响原生质体制备及再生的各种条件,摸索出鸭疫里默氏杆菌TXRA1以Lysozyme 0.1 g/L作用20 min后补加EDTA至终浓度为0.01 mol/L继续作用45 min为最佳试验条件,并成功获得了92%的原生质体制备率和38.77%的再生率。

关键词：鸭疫里默氏杆菌原生质体制备再生

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鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析

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中国兽医学报 2010年第8期30卷 1052-1055页

作者：邵泽香韦强鲍国连崔言顺刘燕王春平季权安李建亮浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021 山东农业大学动物科技学院山东泰安271018

利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术及RACE方法扩增得到鸭肝炎病毒（DHV）浙江分离株Z10的全基因（5′,3′末端序列用RACE法扩增）及4株DHV分离株的VP1基因。结果表明,分离株Z10的全基因片段长7 689 bp,有1个大的开放读码框（ORF... 详细信息

利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术及RACE方法扩增得到鸭肝炎病毒（DHV）浙江分离株Z10的全基因（5′,3′末端序列用RACE法扩增）及4株DHV分离株的VP1基因。结果表明,分离株Z10的全基因片段长7 689 bp,有1个大的开放读码框（ORF）,ORF位于626~7 326位核苷酸,编码2 249个氨基酸。Z10分离株全基因序列与GenBank登录的6株具有代表性的DHV核苷酸序列比对,同源性94.5%~98.4%;所测得的DHV分离株的VP1基因的序列与目前GenBank上发表的具有代表性的DHV-ⅠVP1基因进行比对分析,结果4株Ⅰ型DHV的VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸。4株DHV-Ⅰ之间VP1基因的核苷酸序列同源性为93%~99.7%,氨基酸序列同源性为95.0%~100%;与参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为92.2%~100%,氨基酸序列同源性为95.0%~100%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,属于同一基因群。

关键词： Ⅰ型鸭肝炎病毒 VP1基因 RT-PCR 序列分析

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