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人ZP3嵌合肽在昆虫细胞中的表达及其活性研究

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人ZP3嵌合肽在昆虫细胞中的表达及其活性研究

作者：邱平明暨南大学

学位级别：硕士

人ZP3的第334-341位氨基酸肽段和341-360肽段被证明都存在天然的B细胞表位，而不引起T细胞免疫应答;利用疟原虫(Plasmodium falciparum)的辅助T细胞表位与人ZP3的第334-364肽段串联组成人ZP3的B细胞表位嵌合肽(hZP3 chimeric peptide，h... 详细信息

人ZP3的第334-341位氨基酸肽段和341-360肽段被证明都存在天然的B细胞表位，而不引起T细胞免疫应答;利用疟原虫(Plasmodium falciparum)的辅助T细胞表位与人ZP3的第334-364肽段串联组成人ZP3的B细胞表位嵌合肽(hZP3 chimeric peptide，hCP)，可望成为透明带避孕疫苗理想的候选抗原。人ZP3嵌合肽基因已合成并成功构建重组杆状病毒AcNPV-OCC-hCP。本研究利用重组杆状病毒感染Hi5昆虫细胞，鉴定hCP基因在细胞中的表达，并对其表达条件进行初步探索;利用免疫制备的兔抗rhZP3抗体研究hCP的免疫活性和结合精子能力。选择生长状态良好的Hi5昆虫细胞，用重组杆状病毒AcNPV-OCC-hCP感染，观察感染症状;利用RT-PCR技术检测hCP基因的转录;利用Tricine-SDS-PAGE分析感染后的培养液有无特异蛋白条带，分子量大小;以不同剂量的病毒感染液感染Hi5细胞，感染的持续时间则不同，选择表达量高的感染时间作为最佳表达时间;以甲醇诱导rhZP3重组酵母工程菌 Pichia pastoris X-33的表达产物免疫兔制备抗血清，并应用空白酵母的表达产物做成吸附剂，以中和去除非特异性抗rhZP3的杂抗体;应用免疫组织化学技术，用正常人的含有生长卵泡的卵巢切片与rhZP3抗血清进行反应，以检测抗血清的特异性;利用Western blot技术检测hCP基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性;应用间接竞争ELISA方法检测不同浓度的hCP对rhZP3抗原抗体反应的抑制率;以正常人精子与重组病毒感染的细胞培养液共孵育，利用精子的免疫细胞化学技术，检测hCP结合精子的能力。研究结果表明，重组病毒感染Hi5细胞后，感染症状明显，细胞中有hCPmRNA的转录;蛋白质电泳发现重组病毒感染的昆虫细胞培养液在5.8KD附近有一条特异条带，Western blot技术也在同一位置鉴定出有一条特异条带，但是显色很淡;重组病毒感染Hi5细胞发现感染6天的培养液hCP的表达量最高;用含rhZP3的酵母表达产物免疫兔制备抗血清，经过吸附剂吸附中和以后，抗rhZP3特异性较高，但抗体滴度不高;正常人卵巢利用抗rhZP3血清进行的免疫组化观察ZP呈现棕色;间接竞争性ELISA检测到当重组病毒感染昆虫细胞表达蛋白浓度超过50μg／mL才对rhZP3抗原抗体反应有抑制作用，抑制率回归分析其斜率K值为0.0918;与重组病毒感染液共孵育后的精子免疫细胞化学也观察到在赤道环被染成棕色。研究结果证明，重组杆状病毒感染His昆虫细胞后，hCP基因成功表达，感染时间应控制在5一6天;酵母表达的rhZP3免疫制备的抗血清能够与天然人 ZP发生反应，但抗体滴度不高;hCP与抗rhZ陀血清有一定的反应性，但是活性并不高;精子的赤道环是否是hCP结合位点还有待进一步证实。

关键词：卵透明带 B细胞表位杆状病毒昆虫细胞表达活性

甲基苯丙胺对PC12细胞中二硫键异构酶S亚硝基化的影响

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南方医科大学学报 2017年第1期37卷 93-96页

作者：吴小芳王爱枫邱平明顺德职业技术学院医药卫生学院广东佛山528000 南方医科大学法医学院广东广州510515

目的研究甲基苯丙胺(METH)对PC12细胞中二硫键异构酶(PDI)S亚硝基化的影响以及对神经元的毒性作用。方法不同浓度的METH处理PC12细胞,CCK-8法检测细胞存活率,L-NNA与不同浓度的METH共同处理PC12细胞,生物素转化法检测各细胞内PDI及S亚... 详细信息

目的研究甲基苯丙胺(METH)对PC12细胞中二硫键异构酶(PDI)S亚硝基化的影响以及对神经元的毒性作用。方法不同浓度的METH处理PC12细胞,CCK-8法检测细胞存活率,L-NNA与不同浓度的METH共同处理PC12细胞,生物素转化法检测各细胞内PDI及S亚硝基化PDI(PDI-SNO)表达情况,CCK-8法检测细胞存活率情况,HE染色法观察细胞形态学变化。结果METH使得PC12细胞存活率降低,PDI-SNO表达率增高,当同时用一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)与METH共同处理细胞时,L-NNA可有效地提高细胞的存活率,抑制PDI-SNO的表达率。结论 METH可对PC12细胞产生明显毒性作用,且使PC12细胞中的PDI发生显著的S亚硝基化。

关键词：甲基苯丙胺 PC12细胞二硫键异构酶

尼莫地平对脑血管痉挛鼠体感诱发电位和脑组织内皮素-1含量的影响

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中国老年学杂志 2001年第1期21卷 69-71页

作者：孙保亮夏作理杨明峰邱平明泰山医学院附属医院山东泰安271000

目的　探讨蛛网膜下腔出血 (SAH)后脑血管痉挛 (CVS)对体感诱发电位 (SEP)和脑组织内皮素 - 1 (ET- 1 )的影响 ,及尼莫地平 (ND)的保护作用。方法　对单纯 SAH组和 ND处理组大鼠观察手术前后基底动脉管径 ,并检测 2 4 h内局部脑血流量 (... 详细信息

目的　探讨蛛网膜下腔出血 (SAH)后脑血管痉挛 (CVS)对体感诱发电位 (SEP)和脑组织内皮素 - 1 (ET- 1 )的影响 ,及尼莫地平 (ND)的保护作用。方法　对单纯 SAH组和 ND处理组大鼠观察手术前后基底动脉管径 ,并检测 2 4 h内局部脑血流量 (r CBF)、SEP及脑组织 ET- 1含量的动态变化。结果　 SAH组大鼠在诱导 SAH后 r CBF立即降低 ,并持续 2 4 h,同时有基底动脉痉挛 ;SAH后 1h开始至 2 4 h SEP潜伏期逐渐延长 ,脑组织 ET- 1含量显著增加。 ND使上述变化均明显减轻。结论　 SAH后 CVS可通过脑血流的降低、脑组织 ET- 1增加而导致 SEP潜伏期延长。

关键词：网膜下腔出血脑血管痉挛体感诱发电位内皮素尼莫地平

大鼠蛛网膜下腔出血后急性脑血管痉挛血及脑组织一氧化氮和内皮素含量的动态观察

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中国老年学杂志 2000年第1期20卷 39-40页

作者：孙保亮夏作理杨明峰高美常邱平明泰山医学院附属医院老年病科泰安271000

目的　探讨一氧化氮 (NO)、内皮素 (ET)在蛛网膜下腔出血 (SAH)后急性脑血管痉挛 (CVS)中的作用。方法　对SAH模型组和假手术组大鼠检测术后 2 4 h内局部脑血流量 (r CBF)、血浆及脑组织 NO、ET含量的动态改变 ,并测量基底动脉(BA)管径 ... 详细信息

目的　探讨一氧化氮 (NO)、内皮素 (ET)在蛛网膜下腔出血 (SAH)后急性脑血管痉挛 (CVS)中的作用。方法　对SAH模型组和假手术组大鼠检测术后 2 4 h内局部脑血流量 (r CBF)、血浆及脑组织 NO、ET含量的动态改变 ,并测量基底动脉(BA)管径 ,3d后行海马组织病理检查。结果　 SAH后 2 4 h内 r CBF迅速而持续降低 ,BA痉挛 ;3d后海马 CA1区神经元明显受损 ,血清 NO明显减少 ,脑组织 NO显著增多 ,血浆及脑组织 ET明显增加。结论　血 NO减少、ET增加在 SAH后急性 CVS发生中起重要作用 ;脑组织 NO及 ET增多加重急性 CVS所致脑缺血性损伤。

关键词：蛛网膜下腔出血脑血管痉挛一氧化氮内皮素

银杏叶制剂对蛛网膜下腔出血鼠体感诱发电位和一氧化氮的影响

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中国中药杂志 2001年第5期26卷 329-332页

作者：孙保亮夏作理杨明峰邱平明泰山医学院附属医院神经内科山东泰安271000

目的 :探讨蛛网膜下腔出血 (SAH)后体感诱发电位 (SEP)和一氧化氮 (NO)变化及银杏叶制剂 (EGb)的影响。方法 :对假手术对照组、SAH模型组和EGb处理组大鼠检测 2 4h内局部脑血流量 (rCBF)、SEP和血清及脑组织NO含量动态变化。结果 :SAH... 详细信息

目的 :探讨蛛网膜下腔出血 (SAH)后体感诱发电位 (SEP)和一氧化氮 (NO)变化及银杏叶制剂 (EGb)的影响。方法 :对假手术对照组、SAH模型组和EGb处理组大鼠检测 2 4h内局部脑血流量 (rCBF)、SEP和血清及脑组织NO含量动态变化。结果 :SAH模型组大鼠于SAH后rCBF立即降低 ,在 2 4h内无恢复趋势 ,SEP潜伏期于SAH后 1h开始明显延长 ,血清和脑组织NO含量于SAH后 1h开始分别显著减少或明显增加 ,并持续 2 4h。‘EGb处理组大鼠上述指标的异常变化均较轻。结论 :SEP对SAH后脑缺血损害的判断有重要意义。血清NO减少、脑组织NO增加分别在脑血管痉挛发生及加重脑缺血损害中起重要作用。

关键词：蛛网膜下腔出血脑血流量电生理一氧化氮银杏制剂

一氧化氮与脑血管痉挛性神经元损伤和L-精氨酸的作用

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中国病理生理杂志 2004年第1期20卷 76-79页

作者：孙保亮张苏明夏作理杨明峰邱平明袁慧华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科湖北武汉430030 泰山医学院附属医院神经内科山东泰安271000

目的 :探讨一氧化氮 (NO)与蛛网膜下腔出血 (SAH)后脑血管痉挛 (CVS)所致神经元损伤的关系及L-精氨酸 (L -Arg)的保护作用。方法 :应用血管内穿刺法建立大鼠SAH模型 ,将动物随机分为假手术组 (SO组 )、SAH组和SAH +L -Arg组。动态检测 2... 详细信息

目的 :探讨一氧化氮 (NO)与蛛网膜下腔出血 (SAH)后脑血管痉挛 (CVS)所致神经元损伤的关系及L-精氨酸 (L -Arg)的保护作用。方法 :应用血管内穿刺法建立大鼠SAH模型 ,将动物随机分为假手术组 (SO组 )、SAH组和SAH +L -Arg组。动态检测 2 4h内大脑顶叶皮层局部脑血流量 (rCBF) ,测量基底动脉 (BA)管径变化 ,测定不同时点血清NO(NO-2 /NO-3 )水平和血浆ET -1含量 ,并行海马神经元形态学观察。结果 :假手术对各项指标无显著影响。SAH组术后rCBF迅速降低 ,1h达最低值 ,并持续 2 4h ;SAH后BA管径明显缩小 ;血清NO-2 /NO-3 含量明显减少 ,血浆ET -1含量逐渐增加 ,海马神经元显著损伤。与SAH组比较 ,SAH +L -Arg组rCBF下降的速度减慢、程度减轻 ;BA管径缩小的程度减轻 ;血清NO-2 /NO-3 水平降低和血浆ET -1含量增高的变化减轻 ;海马神经元损伤的程度减轻。结论 :血清NO浓度的降低参与了CVS性神经元损伤 ,L

关键词：蛛网膜下腔出血一氧化氮内皮缩血管肽类脑血管痉挛性神经元损伤 L-精氨酸脑血管疾病

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外源性L-精氨酸对大鼠脑血管痉挛的影响

中国医院药学杂志 2003年第5期23卷 260-262页

作者：孙保亮张苏明夏作理杨明峰邱平明袁慧华中科技大学同济医学院附属同济医院湖北武汉430030 泰山医学院附属医院山东泰安271000

目的:探讨L-精氨酸(L-Arg)对蛛网膜下腔出血(SAH)所致脑血管痉挛(CVS)的影响。方法:应用脑底动脉环血管内穿刺法建立大鼠SAH模型,将动物分为假手术组(SO组)、SAH组和SAH+L-Arg组。动态检测24h内顶叶皮层局部脑血流量(rCBF),测量基底动脉... 详细信息

目的:探讨L-精氨酸(L-Arg)对蛛网膜下腔出血(SAH)所致脑血管痉挛(CVS)的影响。方法:应用脑底动脉环血管内穿刺法建立大鼠SAH模型,将动物分为假手术组(SO组)、SAH组和SAH+L-Arg组。动态检测24h内顶叶皮层局部脑血流量(rCBF),测量基底动脉(BA)管径,并测定不同时点脑组织内皮素-1(ET-1)含量。结果:假手术组对各项指标无显著影响。SAH组术后 rCBF迅速降低,并持续24h;SAH后BA管径明显缩小;脑组织ET-1含量逐渐增加。与SAH组比较,SAH+L-Arg组rCBF下降的速度减慢、程度减轻,BA管径缩小的程度减轻,脑组织ET-1含量增加的幅度减小。结论:L-Arg通过增加NO产生、抑制ET-1生成而缓解SAH后CVS。

关键词：外源性 L-精氨酸大鼠脑血管痉挛影响

鼠脑血管痉挛时尼莫地平对体感诱发电位的影响

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中风与神经疾病杂志 2001年第1期18卷 29-31页

作者：孙保亮夏作理杨明峰戴小牛邱平明泰山医学院附属医院神经内科山东泰安271000 南京铁道医学院生理教研室江苏南京210000

目的探讨蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)对体感诱发电位(SEP)的影响，及尼莫地平(ND)的保护作用。方法对单纯SAH组和ND处理组大鼠观察手术前后基底动脉管径，并检测24h内局部脑血流量(rCBF)、SEP潜伏期及脑组织内皮素-1(ET-1)... 详细信息

目的探讨蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)对体感诱发电位(SEP)的影响，及尼莫地平(ND)的保护作用。方法对单纯SAH组和ND处理组大鼠观察手术前后基底动脉管径，并检测24h内局部脑血流量(rCBF)、SEP潜伏期及脑组织内皮素-1(ET-1)含量的动态变化。结果 SAH组大鼠在诱导SAH后rCBF立即降低，并持续24h，同时有基底动脉痉挛；SAH后1h开始至24h SEP潜伏期逐渐延长，脑组织ET-1含量显著增加。ND处理组大鼠上述变化均较轻。结论 SAH后CVS可通过脑血流的降低、脑组织ET-1增加而导致SEP潜伏期延长，ND通过拮抗脑组织ET-1变化而对之具有保护作用。

关键词：蛛网膜下腔出血脑血管痉挛电生理学内皮素尼莫地平大鼠体感诱发电位

蛛网膜下腔出血大鼠体感诱发电位、血清及脑组织一氧化氮研究

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上海医学 2000年第4期23卷 225-227页

作者：孙保亮夏作理邱平明杨明峰房玉珍高美常泰山医学院附属医院微循环研究所神经病学教研室山东泰安市271000

目的　探讨蛛网膜下腔出血 (SAH)后体感诱发电位 (SEP)、血清及脑组织一氧化氮 (NO)含量变化。方法　对假手术对照组和模型组大鼠检测 2 4h内局部脑血流量 (rCBF)、SEP和血清及脑组织NO含量。结果　模型组SAH后rCBF立即降低 ,在 2 4h内... 详细信息

目的　探讨蛛网膜下腔出血 (SAH)后体感诱发电位 (SEP)、血清及脑组织一氧化氮 (NO)含量变化。方法　对假手术对照组和模型组大鼠检测 2 4h内局部脑血流量 (rCBF)、SEP和血清及脑组织NO含量。结果　模型组SAH后rCBF立即降低 ,在 2 4h内无恢复趋势 ;SEP潜伏期于SAH后 1～ 2 4h明显延长 ;血清和脑组织NO含量于SAH后 1h开始分别显著减少和明显增加 ,并持续 2 4h。结论　SEP对SAH后脑缺血损害的判断有重要意义。血清NO减少、脑组织NO增加分别在脑血管痉挛发生及加重脑缺血损害中起重要作用。

关键词：蛛网膜下腔出血体感诱发电位一氧化氮大鼠