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草鱼巨噬细胞相关因子的克隆与表达分析

草鱼巨噬细胞相关因子的克隆与表达分析

作者：邬恺正上海海洋大学

学位级别：硕士

炎症发生往往伴随着先天免疫系统的激活,随后单核细胞分化为巨噬细胞。在免疫细胞中,巨噬细胞是一种关键的细胞类型,它不仅通过吞噬作用进行清除微生物和碎片,还控制着创面愈合等过程,因此在炎症和可能导致疾病的过程中扮演着至关重要... 详细信息

炎症发生往往伴随着先天免疫系统的激活,随后单核细胞分化为巨噬细胞。在免疫细胞中,巨噬细胞是一种关键的细胞类型,它不仅通过吞噬作用进行清除微生物和碎片,还控制着创面愈合等过程,因此在炎症和可能导致疾病的过程中扮演着至关重要的角色。白细胞介素-1家族(interleukin-1,IL-1)是介导炎症信号的主要成分之一。芳香烃受体(arylhydrocarbon receptor,Ah R)是一种能够控制适应性免疫反应的重要转录调节因子。本研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus,Ci)作为研究模型,克隆了新型IL-1家族成员il-1fmb以及芳香烃受体同源物ahr1a,深入探究了IL-1Fmb和Ah R1a的表达和功能,初步发现新型IL-1家族成员IL-Fmb可能作为一种促炎因子在硬骨鱼类的免疫系统中行使功能,而Ah R1a可能受到炎症因子的调控。研究内容如下:1.本研究通过与斑马鱼基因组库进行比对,通过c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification c DNA ends,RACE)克隆并鉴定了草鱼il-1fmb和ahr1a。其中il-1fmb基因c DNA全长837 bp,其中包括5’非编码区(untranslated region,UTR)37 bp,3’UTR 77 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)723 bp编码240个氨基酸(AA),不含有典型的信号肽结构域。多重序列比对以及酶切位点预测表明IL-1Fmb不含有典型的炎性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)酶切位点,但在IL-1家族结构域前存在中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase)的切割位点V、V、V、A、A、A、V。IL-1Fmb与其他IL-1家族成员的同源性不高,与斑马鱼IL-1Fmb的一致性为41.8%。IL-1Fmb含有5个外显子,4个内含子。系统进化树和基因共线性表明IL-1Fmb在硬骨鱼类进化中较为保守。草鱼ahr1a c DNA全长2 893 bp,包括5’UTR 292 bp和3’UTR 57 bp,ORF 2 544bp,编码847个氨基酸。草鱼Ah R1a与黄河鲤(Cyprinus carpio)相似性与一致性最高,分别为81.5%和74.7%,与其他物种的Ah R1a(Ah R)相似性和一致性也达到了45.4%和38.8%以上。2.为了更好的研究与确定IL-1Fmb的生物学功能,本研究将预测的CiIL-1Fmb成熟肽片段(F-Y)和CiIL-1β(F-K)克隆至p ET-21d原核表达载体,通过大肠杆菌表达系统获得了重组蛋白,并使用凝胶层析和亲和层析的方式对其进行纯化。使用CiIL-1Fmb和CiIL-1β重组蛋白制备了单克隆抗体,利用免疫印迹法(Western Bloting)各自筛选出两株杂交瘤细胞株对其进行纯化和标记。纯化后的抗体能够很好的检测到转染CiIL-1Fmb和CiIL-1β的EPC细胞。3.通过实时荧光定量PCR技术分析CiIL-1Fmb和Ciahr1a在健康草鱼中的表达。结果表明,CiIL-1Fmb和Ciahr1a在各组织中均呈现组成型表达,其中CiIL-1Fmb在鳃和脾中表达量最高,Ciahr1a在肠和鳃中表达量最高。为了探究IL-1Fmb和Ah R1a在免疫反应中发挥的功能,本研究使用LPS刺激草鱼原代头肾细胞后,发现il-1fmb在6 h mRNA表达量达到顶峰之后并在12和24 h降低,ahr1a表达水平在LPS刺激6 h后受到明显下降,12、24 h后恢复到本底水平。在6 h和12 h使用CiIL-1β重组蛋白刺激能够降低ahr1a表达水平。相较于单独刺激,6 h时LPS和r IL-1Fmb共刺激会显著提升il-1β、il-6、il-8和il-10的表达水平,而对IL-1另外两位家族成员il-1fma和il-1fmb没有影响。r IL-1β和r IL-1Fmb的共刺激对il-1β、il-fma、il-6、il-1fmb、il-8和il-10的表达水平没有显著影响。为了探究IL-1Fmb是否对NFкB通路具有影响,通过使用r IL-1Fmb、r IL-1β和LPS刺激转染人源NFкB启动子的草鱼卵巢细胞检测对启动子的影响。结果表明LPS(4944.63±245.46)能够显著增强人源NFкB启动子的荧光素酶活性,而r IL-1Fmb(6970.04±361.56)和r IL-1β(6804.21±241.22)能够极显著增强其荧光素酶活性,这些结果暗示IL-1Fmb对NFкB通路发挥着作用。上述结果暗示草鱼IL-1Fmb参与促炎调控,并且很有可能通过NFкB途径进行信号传导;而Ah R1a的表达水平也受到促炎因子的调控,暗示其在炎症

关键词：草鱼巨噬细胞新型IL-1家族成员IL-1Fmb 芳香烃受体炎症

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YS公司农村电子商务发展模式改进的探讨

YS公司农村电子商务发展模式改进的探讨

作者：邬一恺苏州大学

学位级别：硕士

随着农村的经济发展和互联网的普及,农村电子商务开始蓬勃发展。YS公司根据国务院2014年一号文件精神和区政府发展规划,背靠吴江区供销合作总社,整合资源,在本地农村开展“电子商务进农村”工作。随着本地乡镇的经济发展和社会环境变化... 详细信息

随着农村的经济发展和互联网的普及,农村电子商务开始蓬勃发展。YS公司根据国务院2014年一号文件精神和区政府发展规划,背靠吴江区供销合作总社,整合资源,在本地农村开展“电子商务进农村”工作。随着本地乡镇的经济发展和社会环境变化,YS公司在发展中出现很多问题,需要对发展模式进行改进。本文首先结合理论,对农村电子商务发展模式的概念进行了阐述。其次,对当前农村电子商务发展的主要模式进行了简单归纳。在对农村电子商务发展影响因素的国内外文献进行收集梳理和综述后,发现2010年以来,以国有控制企业或私营企业角度开展的研究涉及较少。再次,将YS公司作为案例分析、回顾YS公司本地农村电子商务业务的发展历程,对发展过程中历经的模式进行总结归纳,即初期的政府主导型模式、发展期的合作社主导型模式和当前的企业主导型模式,最后,结合了 YS公司现状的问卷调查和销售数据进行了分析。根据YS公司当下运营中出现的问题进行内外因分析,认为在今后的发展中,如果仅以某一种单一的发展模式无法适应YS公司的需要,因此立足实际情况,基于三种模式进行优化,最终得出“政府+企业+合作社”复合型的发展模式。本文介绍了复合型发展模式改进框架和方案,并对改进方案的保障措施进行了简单介绍。通过以上研究,本文得出结论:（1）在“互联网+”时代,农村电子商务各方参与者均有着较快发展,任何一种单一的发展模式均不能完全适应当下吴江区农村电子商务市场发展需求。（2）YS公司本身属性复杂,政府机关主导型、合作社主导型、企业主导型在当前YS公司农村电子商务业务的发展中均具有不可替代的优势,故需要综合三种模式,建立起复合型的发展模式才能更好适应市场的发展趋势。（3）复合型的发展模式根据初步检验是行之有效的改进策略,但是仅仅只是一个初步粗略的发展方向。基于社会环境和经济环境等复杂的影响因素,YS公司在发展中将面临不断变化的动态环境,发展模式的改进实施还将会遇到很多问题,有待进一步深入地研究和探讨。

关键词：农村电子商务模式改进复合发展案例研究

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“新法兰西”形成、发展及败因初探

中山大学研究生学刊（社会科学版） 1998年第2期19卷 52-58页

作者：邬恺山中山大学历史系

自地理大发现以来,英法之间围绕北美大陆的归属问题进行了长期的、激烈的斗争,这段历史对于日后欧洲政治局势、对于北美独立战争乃至今天加拿大社会的发展都有深远的影响。本文简要回顾了法属北美殖民帝国,即"新法兰西"的历史进程,并试... 详细信息

自地理大发现以来,英法之间围绕北美大陆的归属问题进行了长期的、激烈的斗争,这段历史对于日后欧洲政治局势、对于北美独立战争乃至今天加拿大社会的发展都有深远的影响。本文简要回顾了法属北美殖民帝国,即"新法兰西"的历史进程,并试图从海外属地的角度分析法国在"七年战争"中战败的原因。

关键词：新法兰西魁北克易洛魁联盟七年战争巴黎和约(1763) 蒙卡姆

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论群昌水库灌区泄洪建筑物的类型选择

吉林水利 1997年第12期 34-35页

作者：邬家恺洮南市水利勘测设计队

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基于网络环境的工业情报共享平台研究

河南社会科学 2009年第6期17卷 187-189页

作者：邬恺夫马钊张勇马秀峰李彩红河南省工业情报标准信息中心河南郑州450003 郑州大学河南郑州450002

针对目前河南省工业情报领域的实际需求,探讨了工业情报共享体系建设和互联网平台实现方案,并介绍了基于网络环境协调企业、政府、协会和专业机构的工业情报共享平台的系统结构和技术特点。

关键词：网络环境工业情报信息共享

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分布式宽带相控阵雷达波束控制技术

现代雷达 2021年第7期43卷 70-74页

作者：胥志毅邬天恺虞舜华南京电子技术研究所南京210039

介绍了宽带相控阵天线孔径渡越时间延时补偿原理,提出了一种分布式宽带大角度扫描相控阵天线阵面波束控制技术,该技术采用孔径渡越时间分级延时算法和高精度通道相位误差补偿。通过仿真和实测数据,证明了该技术可有效改善宽带相控阵雷... 详细信息

介绍了宽带相控阵天线孔径渡越时间延时补偿原理,提出了一种分布式宽带大角度扫描相控阵天线阵面波束控制技术,该技术采用孔径渡越时间分级延时算法和高精度通道相位误差补偿。通过仿真和实测数据,证明了该技术可有效改善宽带相控阵雷达色散效应,得到性能与系统复杂度之间的平衡,并基于分布式分层求解波束运算控制系统实现了工程化应用。

关键词：宽带相控阵雷达孔径渡越时间波束控制系统分布式

一种基于SerDes总线的机载雷达波控系统设计

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电子测量技术 2021年第11期44卷 33-38页

作者：胥志毅徐弘毅邬天恺郭敏敏南京电子技术研究所南京210039

波控系统是相控阵雷达天线的一个重要的子系统。相控阵天线的波束合成、捷变以及赋形功能都需要由波控系统调度控制完成。传统波控系统由波控分机与波控单元的独立分级和模块组成,不能满足机载雷达空间尺寸小、速率要求高以及线缆布局... 详细信息

波控系统是相控阵雷达天线的一个重要的子系统。相控阵天线的波束合成、捷变以及赋形功能都需要由波控系统调度控制完成。传统波控系统由波控分机与波控单元的独立分级和模块组成,不能满足机载雷达空间尺寸小、速率要求高以及线缆布局轻量化的要求。本文设计并实现了一种基于Serializer/Deserializer(SerDes)总线的波控系统,通过将各模块集成在天线阵面的内部的方式,减小了对体积与重量需求,在模块间使用SerDes总线作为数据传输链路,传输速率达到2Gbit/s的同时大大简化了芯线的连接。对系统/模块的设计、定时同步技术、高速链路设计方法与进行了阐述,最终的天线阵面性能测试结果验证了该系统的可实现性。

关键词：波控系统相控阵雷达 SerDes 高速链路定时同步

草鱼IFNa和IFNd重组蛋白表达、纯化及单克隆抗体制备

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水产学报 2022年第11期46卷 2053-2065页

作者：王梓璇贾钊邬恺正朱晓真王俊亚冯浩邹钧上海海洋大学水产与生命学院湖南师范大学生命科学学院省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室

为系统研究草鱼I型干扰素的合成、分泌和免疫功能，本实验在大肠杆菌中表达并提纯了草鱼IFNa (Ci IFNa)和IFNd (Ci IFNd)重组蛋白。将Ci IFNa和Ci IFNd成熟肽分别克隆到pET-21d或pEHISTEVb表达载体上，并转化到大肠杆菌中；IPTG诱导表... 详细信息

为系统研究草鱼I型干扰素的合成、分泌和免疫功能，本实验在大肠杆菌中表达并提纯了草鱼IFNa (Ci IFNa)和IFNd (Ci IFNd)重组蛋白。将Ci IFNa和Ci IFNd成熟肽分别克隆到pET-21d或pEHISTEVb表达载体上，并转化到大肠杆菌中；IPTG诱导表达获得Ci IFNa和Ci IFNd成熟肽的包涵体，经盐酸胍变性、蛋白复性和浓缩后，利用分子筛层析获得了纯度较高的重组蛋白。用重组蛋白免疫小鼠，通过PEG法诱导得到杂交瘤细胞；将稳定分泌抗体的阳性细胞株细胞悬液注射入小鼠腹腔，制备腹水抗体并进行纯化。本实验纯化了草鱼Ci IFNa和Ci IFNd各2株抗体，并采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白质印迹法(Western blot)和免疫荧光法对其进行了较全面的鉴定。实验表明，Ci IFNa和Ci IFNd单克隆抗体特异性好、效价高，能够特异识别在大肠杆菌和真核细胞中表达的重组蛋白，且不存在Ci IFNa和Ci IFNd分子间的交叉识别。本研究制备的单克隆抗体为深入研究草鱼干扰素的细胞来源和蛋白表达规律奠定基础。

关键词：草鱼干扰素细胞因子单克隆抗体重组蛋白

草鱼芳香烃受体ahr1a基因克隆、表达及进化分析

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上海海洋大学学报 2023年第1期32卷 40-52页

作者：邬恺正王俊亚范丁月李仕然徐兢王梓璇邹钧上海海洋大学水产与生命学院上海201306

芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)作为配体激活的转录因子在T细胞、单核细胞和树突状细胞(Dendritic cells,DCs)的功能调节方面扮演重要角色,炎症相关细胞因子的产生与AhR信号通路也密切相关。为阐明草鱼(Ctenopharyngodon id... 详细信息

芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)作为配体激活的转录因子在T细胞、单核细胞和树突状细胞(Dendritic cells,DCs)的功能调节方面扮演重要角色,炎症相关细胞因子的产生与AhR信号通路也密切相关。为阐明草鱼(Ctenopharyngodon idella)ahr1a基因在炎症发生过程中的作用,本研究克隆获得了草鱼ahr1a基因cDNA序列,全长2893 bp,其编码区共2544 bp,编码847个氨基酸。结构域预测发现草鱼AhR1a蛋白含有螺旋-环-螺旋(Helix-loop-helix,HLH)超家族中bHLH-PAS(Period-aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator single minded,Pre-Arnt-Sim)亚家族的典型结构域。氨基酸序列分析表明,草鱼AhR1a与黄河鲤(Cyprinus carpio)的相似性与一致性最高。系统进化树结果发现草鱼ahr1a基因与金鱼(Carassius auratus)、黄河鲤和斑马鱼(Danio rerio)的同源基因聚在一支。草鱼ahr1a基因在多个组织(肠、鳃、肾、肝、头肾、胸腺、脾、皮肤、脑)中均有表达,其中肠和鳃表达量最高。草鱼感染柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)后,ahr1a在脾(24、48 h)和头肾(12、24 h)中的表达水平显著下降。腹腔注射草鱼呼肠孤病毒(Reovirus of grass carp,GCRV)后,脾和头肾中ahr1a表达水平无明显变化。体外实验结果显示,脂多糖(Lipopolysaccride,LPS)和IL-1β重组蛋白下调草鱼原代头肾白细胞中ahr1a的表达。综上所述,本研究克隆分析了草鱼ahr1a基因并初步证实其参与炎症反应的调控。

关键词：草鱼芳香烃受体基因克隆免疫反应