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土耳其斯坦东毕吸虫成虫cDNA文库的构建

中国人兽共患病杂志 2004年第7期20卷 637-639页

作者：邢继兰王春仁何国声中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所上海200232 黑龙江兽医科学研究所

按照SMARTcDNA文库构建试剂盒说明 ,以TRIZOL试剂提取的土耳其斯坦东毕吸虫成虫总RNA为模板 ,以含SfiⅠB酶切位点的oligo(dT)为引物反转录合成第一链cDNA ,利用含SfiⅠA酶切位点的SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA 5’端延伸出去的模板 ... 详细信息

按照SMARTcDNA文库构建试剂盒说明 ,以TRIZOL试剂提取的土耳其斯坦东毕吸虫成虫总RNA为模板 ,以含SfiⅠB酶切位点的oligo(dT)为引物反转录合成第一链cDNA ,利用含SfiⅠA酶切位点的SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA 5’端延伸出去的模板 ,采用LD -PCR技术以改良的oligo(dT)引物合成双链cDNA ,经蛋白酶K和SfiⅠ消化后 ,过CHROMASPIN - 4 0 0柱进行分级分离。双链cDNA与载体λTripEx2两臂连接 ,体外包装后构建成土耳其斯坦东毕吸虫成虫的cDNA噬菌体表达文库。经测定文库容量为 6 38× 10 6,文库扩增后的滴度为 3 4 8× 10 10 (Pfu/ml) ,PCR测定的重组率为 92 %。各项指标表明 ,我们成功的构建了高质量的cDNA文库 ,为进一步筛选、克隆保护性抗原基因奠定了基础。

关键词：土耳其斯坦东毕吸虫成虫 cDNA文库构建核苷酸

猪流感病毒抗原表位基因表达载体构建与免疫原性分析

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生物工程学报 2008年第4期24卷 690-694页

作者：刘惠莉邢继兰潘洁杨秋峰赵艳敏上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海201106

根据猪流感病毒血凝素蛋白基因(Heamuglutinine,HA)的核苷酸序列,设计、筛选HA蛋白氨基酸序列的主要表位多肽4个,将4个片段以柔性连接串联成模拟蛋白,核苷酸约为300 bp,体外扩增该模拟蛋白基因,插入到原核表达载体pET30a(+)中,转染宿主... 详细信息

根据猪流感病毒血凝素蛋白基因(Heamuglutinine,HA)的核苷酸序列,设计、筛选HA蛋白氨基酸序列的主要表位多肽4个,将4个片段以柔性连接串联成模拟蛋白,核苷酸约为300 bp,体外扩增该模拟蛋白基因,插入到原核表达载体pET30a(+)中,转染宿主菌诱导表达,结果获得分子量为20 kD的表达蛋白,该蛋白可与抗His-tag抗体、抗猪流感病毒H1N1、H3N2亚型高免血清发生免疫学反应。纯化后免疫小鼠,ELISA及血凝抑制(Heamuglutinine inhibitor,HI)试验检测,小鼠产生针对多肽抗原的血清抗体,同时还可检测到H1N1、H3N2亚型SIV血凝抗体。流氏细胞仪检测免疫组外周血淋巴细胞高于对照组,说明该模拟蛋白具有与H1N1、H3N2亚型猪流感病毒相似的免疫原性及反应原性,为H1N1、H3N2血清亚型猪流感病毒疫苗研制提供了新手段。

关键词：猪流感病毒抗原表位新型疫苗

大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的表达及活性研究

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中国预防兽医学报 2008年第1期30卷 30-34,52页

作者：赵艳敏刘惠莉邢继兰潘洁曹祥荣南京师范大学生命科学学院上海农业科学院畜牧兽医研究所上海市农业遗传育种重点实验室上海201106

利用重叠延伸PCR扩增技术,体外获得大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)突变体LTK63、LTR72和LTG192全基因片段,酶切和测序结果表明构建的表达载体pET30a-LT、pET30a-LTK63、pET30a-LTR72、pET30a-LTG192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换... 详细信息

利用重叠延伸PCR扩增技术,体外获得大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)突变体LTK63、LTR72和LTG192全基因片段,酶切和测序结果表明构建的表达载体pET30a-LT、pET30a-LTK63、pET30a-LTR72、pET30a-LTG192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换。诱导表达产物用SDS-PAGE检测,野生型LT蛋白及3个突变体均表达出约33.0Ku和13.0Ku的2个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量大小相吻合;Westernblot检测,2个蛋白带均可与抗His抗体发生特异性免疫反应,而13.0Ku的蛋白带还可与抗霍乱毒素(CT)抗体发生免疫学反应。ADP-核糖转移酶活性试验分析,各突变体蛋白酶活性均低于野生型LT蛋白,但仍保留一些酶活性。Patent-mouse毒性试验检测,LTK63、LTR72和LTG192突变体蛋白的毒性均有不同程度降低,LTK63毒性降低最显著,LTG192蛋白毒性相对较大。

关键词：大肠杆菌不耐热肠毒素突变体表达

4种终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫cox1和nad1基因的序列分析

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中国兽医科学 2008年第4期38卷 303-307页

作者：李利邢继兰王春仁翟延庆何国声黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海201106 中国农业科学院上海兽医研究所上海200232

收集黑龙江省大庆地区牛源、绵羊源、绒山羊源和山羊源土耳其斯坦东毕吸虫，以SDS-蛋白酶K法抽提其基因组DNA，用特异性引物通过PCR扩增土耳其斯坦东毕吸虫成虫细胞色素C氧化酶亚基1基因（coxl）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1基因... 详细信息

收集黑龙江省大庆地区牛源、绵羊源、绒山羊源和山羊源土耳其斯坦东毕吸虫，以SDS-蛋白酶K法抽提其基因组DNA，用特异性引物通过PCR扩增土耳其斯坦东毕吸虫成虫细胞色素C氧化酶亚基1基因（coxl）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1基因（nad1）并进行测序，应用Chromas和DNAStar软件分析扩增产物的变异情况。结果表明，大庆地区4种终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫cox1基因均为1125bp，nad1基因均为518bp；且其线粒体基因存在差异，coxl的同源性为99．0％～99．7％，nad1的同源性为98．3％～99．4％。

关键词：土耳其斯坦东毕吸虫细胞色素C氧化酶亚基1基因烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1基因序列分析

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多重RT-PCR检测猪流感病毒及血清亚型

中国兽医学报 2008年第11期28卷 1262-1265页

作者：刘惠莉周宗清邢继兰潘洁杨秋峰饶柏忠上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海市农业遗传育种重点实验室上海201106

根据GenBank登录的猪流感病毒各血清亚型NP基因,H1、H3亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因核苷酸序列,经DNAstar软件类比选择保守区设计引物,sPCR筛选出引物对,用于扩增猪流感病毒NP基因、血凝素H1/H3亚型、神经氨酸酶N1/N2亚型基因片段。根... 详细信息

根据GenBank登录的猪流感病毒各血清亚型NP基因,H1、H3亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因核苷酸序列,经DNAstar软件类比选择保守区设计引物,sPCR筛选出引物对,用于扩增猪流感病毒NP基因、血凝素H1/H3亚型、神经氨酸酶N1/N2亚型基因片段。根据NP、H1N1、H3N2亚型引物扩增片段大小和反应条件的差异,将各引物配比组合,形成引物组合,建立多重RT-PCR体系。经对不同亚型模板的扩增、检验,建立的2个多重RT-PCR体系可用于猪流感病毒及H1/H3血凝素亚型、N1/N2神经氨酸酶亚型的快速鉴别、诊断。特异性试验检测多重RT-PCR不能扩增其他猪病毒核酸,核酸的最低检测量达0.2ng。采集临床具有呼吸道症状的猪肺、鼻腔棉试子等85份,与鸡胚分离及血凝/血凝抑制试验比较,阴性样品检测符合率达100%。

关键词：猪流感病毒血凝素亚型神经氨酸酶亚型多重RT—PCR

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多重PCR检测禽流感病毒血清亚型的研究

多重PCR检测禽流感病毒血清亚型的研究

口蹄疫病毒结构蛋白基因vp1的表达与应用研究

中国畜牧兽医学会禽病学分会第十三次学术研讨会

作者：刘惠莉邢继兰周宗清陈波潘洁上海市农业科学院畜牧兽医研究所

下载Genebank各种亚型NP基因模板,H5、H9亚型HA序列,N1、N2亚型NA序列,经Dnastar类比选择保守区设计引物,sPCR筛选出引物对。用于血凝素和神经氨酸酶亚型鉴别。根据NP、H5N1、H9N2亚型引物扩增片段大小不同,反应条件的差异,将各引物配... 详细信息

下载Genebank各种亚型NP基因模板,H5、H9亚型HA序列,N1、N2亚型NA序列,经Dnastar类比选择保守区设计引物,sPCR筛选出引物对。用于血凝素和神经氨酸酶亚型鉴别。根据NP、H5N1、H9N2亚型引物扩增片段大小不同,反应条件的差异,将各引物配比组合,形成不同的配组,建立多重PCR体系,经对不同亚型模板的检验,建立的两个多重PCR体系可用于AIV及H5/H9血凝素亚型、N1/N2神经氨酸酶亚型的快速鉴别、诊断。

关键词：禽流感病毒血凝素亚型神经氨酸酶亚型多重PCR

来源： cnki会议评论

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中国预防兽医学报 2007年第4期29卷 299-302页

作者：邢继兰潘洁陈波饶忠尤永进徐泉兴刘惠莉上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海201106

体外克隆口蹄疫病毒vp1基因,构建重组表达载体pET28a-vp1。将此重组质粒转化到受体菌BL21(DE3)中,进行诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明,诱导5h后表达量达到最高,表达产物大小约为33Ku～40Ku,表达蛋白能与口蹄疫病毒阳性血清产生... 详细信息

体外克隆口蹄疫病毒vp1基因,构建重组表达载体pET28a-vp1。将此重组质粒转化到受体菌BL21(DE3)中,进行诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明,诱导5h后表达量达到最高,表达产物大小约为33Ku～40Ku,表达蛋白能与口蹄疫病毒阳性血清产生特异性免疫反应。经HPLC纯化后,以重组蛋白为抗原,建立检测VP1蛋白抗体的ELISA方法,检测猪牛血清样品,免疫抗体检测结果与口蹄疫液相阻断ELISA检测结果呈正相关,能反映出免疫抗体动态变化,对临床样品口蹄疫病毒血清抗体检测,两种方法有一定相关性,但不显著。所以以重组VP1蛋白为检测抗原的ELISA方法有望用于口蹄疫免疫抗体监测。

关键词：口蹄疫病毒结构蛋白 vp1基因表达

土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白基因的原核表达

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中国兽医科学 2006年第3期36卷 212-215页

作者：王春仁仇建华何国声周庆民邢继兰许腊梅黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 黑龙江省兽医科学研究所黑龙江富裕161200 中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所上海200232

将pGEM-TM质粒上的土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白(TM)基因片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+),重组的pET28-TM在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达出一37.5 ku的融合蛋白。该蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测,出... 详细信息

将pGEM-TM质粒上的土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白(TM)基因片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+),重组的pET28-TM在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达出一37.5 ku的融合蛋白。该蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测,出现与目的蛋白大小一致的单一条带。Western-blotting检测结果表明,纯化的蛋白可被自然感染东毕吸虫的山羊血清识别,这为进一步研究东毕吸虫基因工程疫苗奠定了基础。

关键词：土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白基因原核表达

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畜禽养殖业污染的控制

上海畜牧兽医通讯 2007年第3期 75-76页

作者：陈波华修国张忠明潘洁饶钟陈谊邢继兰上海交通大学农业与生物学院 200224 上海市农业科学院畜牧兽医研究所 201106

随着农业的改革、发展,新农村、新产业、新格局促进了农村城镇化,使畜禽业养殖方式和养殖规模发生了重大变化.

关键词：畜禽养殖业污染控制农村产业结构农村城镇化畜禽业养殖规模养殖方式分散经营