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鸡新城疫病毒HN表位抗原多肽的免疫原性鉴定及应用研究

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鸡新城疫病毒HN表位抗原多肽的免疫原性鉴定及应用研究

作者：邢广旭河南农业大学

学位级别：硕士

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）分类上属于副粘病毒科,为有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒,基因组全长约15 kb,编码六种病毒结构蛋白。其中HN和F是NDV最重要的致病性抗原和保护性抗原,在ND的免疫保护中,F和HN起到了... 详细信息

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）分类上属于副粘病毒科,为有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒,基因组全长约15 kb,编码六种病毒结构蛋白。其中HN和F是NDV最重要的致病性抗原和保护性抗原,在ND的免疫保护中,F和HN起到了最重要的保护作用。血凝素一神经氨酸酶（HN）,具有血凝素和神经氨酸酶两种活性,能够吸附于易感细胞的相应受体,在病毒侵染过程中起识别受体的作用。B抗原表位又称抗原决定簇,是抗原分子上能够被抗体分子识别的部位,在蛋白质抗原中一般由几个直接相邻或构象上相邻的氨基酸组成,决定着机体产生抗体的特异性,是诱导体液免疫的基本单位。对以体液免疫反应为主NDV来说,鉴定其B细胞抗原表位便是揭示ND体液免疫的本质。本研究在筛选山两条HN表位抗原合成多肽的基础上,建立了ELISA快速检测方法并组装了试纸条。 1、在应用生物信息学原理分析NDV HN蛋白结构特性的基础上,合成了重叠多肽18条。合成多肽与载体蛋白BSA偶联后,经peptide-ELISA和IDot-ELISA检测其与鸡NDV单克隆抗体或多抗的反应性。结果显示,多肽中含有2个中和性单克隆抗体识别的线性表位:HNO2.DTLEKHTLRSETSTYN;HNO3.ETSTYNLTVGDTGSGL;单克隆抗体识别的抗原表位多肽同时也能够与鸡NDV多抗血清反应。用HNO2和HNO3各白的载体蛋白复合物免疫鸡后,能得到针对多肽的抗体,这就为ND的新型疫曲的研制奠定了基础。 2、基于通过筛选到的两条HN表位抗原多肽,建立了检测NDV抗体的ELISA方法,其灵敏度与HI相当;同时,也基于两条HN表位抗原多肽在胶体金试纸方面做了初步探索,10分钟内其检测限达到61g2。

关键词：鸡新城疫病毒 B细胞抗原表位多肽合成 ELISA 免疫层析试纸

猪流行性腹泻病毒E蛋白诱发细胞未折叠反应的分子机制

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畜牧与兽医 2022年第9期54卷 60-65页

作者：邢广旭焦文强王方雨张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学江苏扬州225009 河南省农业科学院畜牧兽医研究所河南郑州450002 河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室河南郑州450002

为阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV) E蛋白诱导Vero-E6细胞内质网应激分子机制,采用RT-PCR方法扩增得到E蛋白基因,经XhoⅠ和BamHⅠ酶切后与同样酶切的p-EGFP-N1载体使用T4 DNA连接酶进行连接,成功构建了表达载体,与pCDNA 3.1-GRP78共转染Vero... 详细信息

为阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV) E蛋白诱导Vero-E6细胞内质网应激分子机制,采用RT-PCR方法扩增得到E蛋白基因,经XhoⅠ和BamHⅠ酶切后与同样酶切的p-EGFP-N1载体使用T4 DNA连接酶进行连接,成功构建了表达载体,与pCDNA 3.1-GRP78共转染Vero-E6细胞,通过激光共聚焦试验和Western blot验证E蛋白的细胞定位,并揭示其激活细胞内质网应激的分子机制。结果表明,通过共聚焦荧光显微镜证实E蛋白定位在细胞中,Western blot方法验证E蛋白可以上调Vero-E6细胞GRP78蛋白表达水平,诱导Vero细胞内质网应激。进一步采用Western blot验证E蛋白通过PERK-eIF2α信号通路激活未折叠蛋白反应。本研究为探究PEDV致病机制提供了新的思路。

关键词：猪流行性腹泻病毒 E蛋白信号通路

基于功效系数法的企业财务危机预警体系的构建

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市场研究 2014年第2期 60-61页

作者：邢广旭平煤神马集团财务资产部

有效的财务预警对于帮助企业及时发现和消除财务隐患,防止财务危机的发生具有重要的意义。本文在总结国内外财务预警方法的基础上,对功效系数法财务预警体系的构建进行了探讨,希望能够引导企业提高风险意识,加强财务风险管理,保证企业... 详细信息

有效的财务预警对于帮助企业及时发现和消除财务隐患,防止财务危机的发生具有重要的意义。本文在总结国内外财务预警方法的基础上,对功效系数法财务预警体系的构建进行了探讨,希望能够引导企业提高风险意识,加强财务风险管理,保证企业可持续发展。

关键词：企业财务预警功效系数法

侧流胶体金免疫试纸快速测定牛奶中的泰乐菌素

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食品与发酵工业 2022年第12期48卷 261-266页

作者：邢广旭孙雪峰赵东杨继飞赵雅丽张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南农业大学食品科学技术学院河南郑州450002

大环内酯类抗生素是非常重要的一类抗菌化合物,而泰乐菌素(tylosin,TYL)是最常用的预混大环内酯类抗生素。但是,这些药物的残留物会在人体中引起过敏反应,并对抗生素产生抗药性。为了评估TYL的残基,需要灵敏的分析方法以确保低浓度下的... 详细信息

大环内酯类抗生素是非常重要的一类抗菌化合物,而泰乐菌素(tylosin,TYL)是最常用的预混大环内酯类抗生素。但是,这些药物的残留物会在人体中引起过敏反应,并对抗生素产生抗药性。为了评估TYL的残基,需要灵敏的分析方法以确保低浓度下的测定。该文开发了一种快速免疫层析侧流试纸条,用于专门测定牛奶样品中的TYL残留。该文筛选了抗TYL单克隆抗体。抗体滴度为2.56×10^(-5),IC_(50)为4.6091 ng/mL。该测试条由样品垫、共轭垫、包含质控线和线的硝酸纤维素(nitrocellulose membrane,NC)膜以及吸收垫组成。用试纸条测定TYL的不同标准样品(0、2、4、8、16、32、64 ng/mL)。用扫描仪计算出试纸的检出限(limit of detection,LOD)为1.5434 ng/mL,肉眼计算为10 ng/mL,计算其IC_(50)为7.8362 ng/mL,无需特殊设备,测试结果将在20 min内获得。牛奶的平行分析显示从试纸条和HPLC获得的结果相当,试纸与其他兽药无交叉反应。因此,该试纸条非常简便快捷,可作为定量、半定量或定性检测牛奶中TYL残留的筛选方法。

关键词：牛奶泰乐菌素单克隆抗体免疫层析法侧流试纸

宿主膜联蛋白A2与伪狂犬病毒US3蛋白互作及其对细胞凋亡的影响

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畜牧兽医学报 2022年

作者：郭振华李翔翁茂洋金前跃郭军庆邢广旭张改平江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心河南省农业科学院动物免疫学重点实验室西北农林科技大学动物医学院

US3蛋白激酶是伪狂犬病毒（PRV）的一个重要毒力因子，研究显示US3参与了细胞骨架重排、病毒复制和传播、细胞凋亡和干扰素信号通路等多个生物学过程，鉴定新的和US3互作的宿主蛋白对于认识其生物学功能具有重要意义。本研究首先利用免...

US3蛋白激酶是伪狂犬病毒（PRV）的一个重要毒力因子，研究显示US3参与了细胞骨架重排、病毒复制和传播、细胞凋亡和干扰素信号通路等多个生物学过程，鉴定新的和US3互作的宿主蛋白对于认识其生物学功能具有重要意义。本研究首先利用免疫共沉淀和pull-down技术验证了US3和宿主膜联蛋白A2（ANXA2）的相互作用；然后利用RNAi技术，通过荧光定量PCR、病毒滴度测定和免疫印迹分析，发现敲低ANXA2的表达显著抑制了PRV在PK-15细胞上的增殖；进一步发现过表达ANXA2可以抑制PRV或者凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡，提示ANXA2具有负调控细胞凋亡的作用。本研究进一步完善了可以和US3蛋白互作的宿主蛋白成员，加深了我们对ANXA2生物学功能的理解。

关键词：

新霉素快速半定量ELISA试剂盒的研制与应用

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核农学报 2013年第6期27卷 811-816页

作者：邢广旭王方雨胡骁飞邓瑞广张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450000

本研究利用已经筛选的抗新霉素单克隆抗体,直接与辣根过氧化物酶相偶联,确定其相应的工作浓度,建立了快速半定量ELISA试剂盒。结果表明,本研究研制的新霉素(NEO)阻断ELISA试剂盒可在30min内进行半定量检测,其特异性较强,与其它氨基糖苷... 详细信息

本研究利用已经筛选的抗新霉素单克隆抗体,直接与辣根过氧化物酶相偶联,确定其相应的工作浓度,建立了快速半定量ELISA试剂盒。结果表明,本研究研制的新霉素(NEO)阻断ELISA试剂盒可在30min内进行半定量检测,其特异性较强,与其它氨基糖苷类抗生素的交叉反应均比较低;试剂盒的在奶样、饲料和肌肉样品的检测限均为1μg.L-1;NEO-Kit在4℃至少可以保存6个月以上;试剂盒与液相色谱-二级质谱联用方法检测新鲜奶样中NEO含量的结果比较之间无显著差异;对相同浓度的NEO样品回收率无显著差异。NEO快速半定量ELISA试剂盒的成功研制有助于进行现场样品检测,为检测NEO药物的滥用提供了新的快捷检测手段。

关键词：新霉素快速半定量 ELISA 牛奶饲料肌肉

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酶联免疫法检测猪肉中的司帕沙星

现代食品科技 2022年第2期38卷 266-271页

作者：邢广旭赵东孙雪峰温留丁张颖硕张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450003

为了建立一种检测猪肉中司帕沙星(SPFX)残留的方法,并且在检测时具有特异性高,背景低和无需样品预处理的特点。该研究制备了间接竞争性酶联免疫吸附剂和特异性抗司帕沙星单克隆抗体。结果表明,该抗体与氟甲喹(11.99%)、氟罗沙星(11.14%... 详细信息

为了建立一种检测猪肉中司帕沙星(SPFX)残留的方法,并且在检测时具有特异性高,背景低和无需样品预处理的特点。该研究制备了间接竞争性酶联免疫吸附剂和特异性抗司帕沙星单克隆抗体。结果表明,该抗体与氟甲喹(11.99%)、氟罗沙星(11.14%)、恩诺沙星(4.60%)、环丙沙星(0.31%)几乎没有交叉反应。该方法测定了添加SPFX的猪肉中的药物残留,检测内变异系数小于5.68%,检测间变异系数小于5.51%。检测间和检测内的平均回收率分别为102%~106%和101%~104%。该抗体对SPFX的IC_(50)为31μg/L,没有抗体具有四种结构相关化合物和其他化合物。高效液相色谱(HPLC)和酶联免疫吸附试验(ELISA)的结果进一步证实了icELISA快速检测猪肉中SPFX的可靠性和准确性。该研究表明icELISA法检测猪肉中SPFX残留分析是一种可靠、简便、低成本的方法。

关键词：司帕沙星单克隆抗体酶联免疫吸附试验猪肉

基于局域表面等离子体共振(LSPR)的核酸适配体筛选新方法的建立

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河南农业科学 2020年第3期49卷 151-156页

作者：郝俊芳张英涛邢广旭王方雨河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 四川农业大学动物医学院禽病研究中心四川成都611130 河南省科学院生物研究所有限责任公司河南郑州450008

为了快速、高效地筛选到靶标核酸适配体,急需通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)建立一种简便、高效和可视化筛选适配体的新方法.以链霉亲和素(SA)作为靶标模型,利用局域表面等离子体共振(LSPR)和毛细管电泳(CE)相结合的方法进行筛... 详细信息

为了快速、高效地筛选到靶标核酸适配体,急需通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)建立一种简便、高效和可视化筛选适配体的新方法.以链霉亲和素(SA)作为靶标模型,利用局域表面等离子体共振(LSPR)和毛细管电泳(CE)相结合的方法进行筛选和验证.结果显示,在第1轮LSPR-SELEX中,筛选到SA结合的适配体(SBA),并且通过LSPR的Trace Drawer数据分析软件计算出SBA的KD值为107μmol/L;在第2轮LSPR-SELEX中,SBA的KD值为98 nmol/L.结果表明,采用LSPR-SELEX技术经2轮筛选,使SBA的亲和力提高了1000倍.随后,将筛选到的SBA进行CE验证,结果显示,SBA适配体与其靶标SA具有良好的亲和性和特异性.综上,鉴于LSPR从初始DNA文库中分离和收集靶标适配体的高效性,LSPR-SELEX技术可用于核酸适配体的筛选.

关键词：适配体 LSPR-SELEX 链霉亲和素毛细管电泳 KD值

非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株三重荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用

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中国兽医学报 2022年第4期42卷 619-625页

作者：郭振华邢广旭翁茂洋金前跃乔松林张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南农业大学动物医学学院河南郑州450002 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

针对非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R和CD2v基因分别设计了引物和探针,经过条件优化,建立了基于TaqMan探针技术的三重荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法与猪场常见病毒的核酸不发生交叉反应,具有良好的... 详细信息

针对非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R和CD2v基因分别设计了引物和探针,经过条件优化,建立了基于TaqMan探针技术的三重荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法与猪场常见病毒的核酸不发生交叉反应,具有良好的特异性;敏感性分析显示,针对B646L、MGF505-2R和CD2v基因的最低检测下限分别为6.5,8.0和14.0 copies/μL;并且该方法在10~10copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,组间变异系数为0.05%~2.68%,组内变异系数为0.10%~1.17%,稳定性良好。进一步针对临床核酸样品的检测显示,本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的荧光定量PCR鉴别检测方法,为临床非洲猪瘟病毒的监测诊断提供了良好的技术支撑。

关键词：非洲猪瘟病毒荧光定量PCR B646L基因 MGF505-2R基因 CD2v基因