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新型重组TEV蛋白酶的构建、中试规模发酵及纯化

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新型重组TEV蛋白酶的构建、中试规模发酵及纯化

作者：邓淇淇重庆理工大学

学位级别：硕士

烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEVp)是来自烟草蚀刻病毒的27 kDa半胱氨酸蛋白酶,因其优良的序列特异性而成为生物技术中应用最广泛的蛋白酶之一。尽管它具有底物特异性,但在通过大肠杆菌表达时,野生型TEV蛋白酶在这个过程中易受到自裂解和溶解性... 详细信息

烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEVp)是来自烟草蚀刻病毒的27 kDa半胱氨酸蛋白酶,因其优良的序列特异性而成为生物技术中应用最广泛的蛋白酶之一。尽管它具有底物特异性,但在通过大肠杆菌表达时,野生型TEV蛋白酶在这个过程中易受到自裂解和溶解性差的限制。目前研究者们采用多种方法用于提高TEV蛋白酶的表达水平以及活性,其中常见的几种融合标签在改善TEV蛋白酶可溶性、表达水平和酶活性上效果并不完美,主要原因是融合标签分子量较大可能会对TEV蛋白酶结构性质上造成一定的影响,且不利于后期纯化。因此,本课题通过融合钙调蛋白(CAM)和热休克分子伴侣(Gro ES)于TEV蛋白酶中,旨在改善TEV蛋白酶可溶性,从而提高其表达产量。此外,借助钙调蛋白的疏水特性,将有利于实现蛋白酶的高效纯化。本课题首先通过构建表达载体pET28a-cam2-tev、pET28a-cam-tev在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中诱导表达,分别简称为CAM2T、CAMT,进而成功表达并纯化出可溶性重组TEV蛋白酶。与实验室现存寄生虫源TEV蛋白酶FH8Hd TEVRm进行溶解度、表达水平及活性对比分析。结果表明在改善溶解性上CAMT效果优于CAM2T和FH8Hd TEVRm,酶活性大小为CAMT>FH8Hd TEVRm>CAM2T。对CAMT进行15L中试发酵,发现CAMT最终获得的理论表达量略低于FH8Hd TEVRm。基于此,添加分子伴侣Gro ES和TEV蛋白酶识别位点于pET28a-cam-tev序列中,构建出pET28a-groes-tevs-cam-tev表达载体,成功转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞并表达,简称GCAMT。与CAMT进行表达量和活性对比,其结果表明可溶性及表达水平高于CAMT。将CAMT菌株和GCAMT菌株进行15L中试发酵,结果显示获得的GCAMT表达量是CAMT的1.7倍多。通过优化纯化方法,发现在优化后的纯化条件中GCAMT蛋白含量得到明显的提高,每克菌体的蛋白含量平均增加2.15 mg/g,最终收率提高14%左右。并且纯化获得的蛋白含量较高于CAMT,表明分子伴侣Gro ES对蛋白纯化无不利影响。利用酶切实验分析分子伴侣Gro ES对CAMT酶活性的影响,结果表明两者的酶切底物蛋白含量无明显差异,即证明了分子伴侣Gro ES对CAMT酶活性无不利影响,且活性均较好。同时与商品TEV蛋白酶(TEVp-his)进行活性比较,发现GCAMT和实验室FH8Hd TEVRm的活性均高于商品TEVp-his。本课题的目标是在于获得具有高表达、易于纯化和高活性的TEV蛋白酶,同时验证人源性钙调蛋白替代寄生虫源钙结合蛋白的可行性以及Gro ES是否能帮助蛋白质折叠从而提高蛋白表达量。

关键词： TEV蛋白酶钙调蛋白伴侣蛋白表达纯化发酵活性检测

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生物医药企业股票投资价值评估研究

生物医药企业股票投资价值评估研究

作者：魏美淇重庆理工大学

学位级别：硕士

党的二十大报告提出:“江山就是人民,人民就是江山”,强调要不断推动健康中国建设,把人民健康放在发展战略的第一位,指出必须构建多层次的医疗保障体系,提高人民防病治病和健康管理能力,这些政策的利好不断推动着生物医药行业往更好的... 详细信息

党的二十大报告提出:“江山就是人民,人民就是江山”,强调要不断推动健康中国建设,把人民健康放在发展战略的第一位,指出必须构建多层次的医疗保障体系,提高人民防病治病和健康管理能力,这些政策的利好不断推动着生物医药行业往更好的方向发展。随着生物医药行业市场需求的不断提升,行业内部的并购交易愈加频繁,投资者对生物医药企业股票的关注度也不断增加,因此,选择合适的方法对生物医药企业股票的投资价值进行评估,不仅可以为投资者提供评估生物医药企业股票投资价值的依据,使他们识别出具有潜在投资价值的生物医药股票并进行投资,同时也可以带动整个行业的发展。为了构建生物医药企业股票估值模型,为我国生物医药企业股票的投资者提供参考,本文聚焦于生物医药产业链中游的中药、化学药、生物药,选取五家上市企业股票作为案例进行评估分析,以验证评估方法的可行性与合理性。本文选取EVA估值模型,并针对生物医药企业股票的特殊性,对传统EVA估值模型进行一定的改进。首先,对EVA估值模型进行相应的会计调整,合理计算出生物医药企业的历史数据。其次,使用灰色预测GM(1,1)模型改进EVA估值模型,客观合理的预测企业未来财务数据,得到更为客观真实的股票投资价值。再次,用未改进的EVA估值模型检验改进的EVA估值模型的有效性。最后,将两种评估方法的评估值与案例生物医药企业股票评估基准日的股票市价进行对比分析。本文得出以下研究结论,即改进的评估模型更适用于生物医药企业股票投资价值评估,并且部分生物医药企业股票可能具有潜在的投资价值。基于研究,本文提出以下三条建议:一是理性甄别真正具有投资价值的生物医药股票,投资者在投资生物医药企业股票时,需要理性分析认真考虑,在充分研究被投资对象的前提下,合理评估生物医药企业股票的内在价值,识别真正具有投资价值的生物医药企业股票;二是加强对投资者结构、市场信息等的监管,引导投资者进行长期投资,推出长期投资的金融产品,促进市场的稳定发展;三是选用合适的方法评估生物医药股票投资价值,不同的生物医药企业股票可能存在个体差异,应当具体问题具体分析,选用适合被估对象的一种或几种评估方法。

关键词：生物医药企业股票投资价值 EVA估值模型灰色预测模型

气候变化及人类活动影响下永安溪河流水文健康响应

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河海大学学报(自然科学版) 2024年

作者：李铠峰赵超李文彧邓淇耘刘涵李宜润厦门理工学院环境科学与工程学院厦门市水资源利用与保护重点实验室

为充分认识气候变化及人类活动影响下的河流水文健康响应，采用降水-径流双累积曲线法和Pettitt法分析永安溪径流变化，基于气象和径流数据构建流域长短期记忆（LSTM）神经网络模型还原天然流量序列，通过对多种最适宜生态流量的筛选，... 详细信息

为充分认识气候变化及人类活动影响下的河流水文健康响应，采用降水-径流双累积曲线法和Pettitt法分析永安溪径流变化，基于气象和径流数据构建流域长短期记忆（LSTM）神经网络模型还原天然流量序列，通过对多种最适宜生态流量的筛选，揭示永安溪河流水文健康度（RHD）变化，并定量评估各驱动因子的贡献度。结果表明，永安溪径流的突变时间为2003年，与下岸水库运行时间一致；Q50为最适宜生态流量；与人类活动的贡献（34.74%）相比，气候变化（65.26%）是永安溪河流水文健康下降的主要因素；对比还原流量的RHD，下岸水库运行后实测流量的RHD，在3、4、10月呈现明显提升。

关键词：河流水文健康永安溪 LSTM 最适生态流量

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酿酒酵母Y-8对发酵香肠品质与风味的影响

食品科学 2024年第7期45卷 119-126页

作者：范鑫洋张香美刘程鹏纪锡伟车淇河北经贸大学生物科学与工程学院河北石家庄050061

为改善发酵香肠的品质与风味,将酿酒酵母Y-8接种到发酵香肠中,探究不同比例酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y-8与植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)Z43复配对发酵香肠理化性质、挥发性风味物质与脂肪酸的影响。分别通过... 详细信息

为改善发酵香肠的品质与风味,将酿酒酵母Y-8接种到发酵香肠中,探究不同比例酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y-8与植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)Z43复配对发酵香肠理化性质、挥发性风味物质与脂肪酸的影响。分别通过气相色谱-离子迁移谱、气相色谱-质谱联用技术测定挥发性风味物质与脂肪酸。结果表明:添加酿酒酵母Y-8可以促进发酵香肠中酯类和醇类物质产生、降低乙酸含量、提高最终pH值、增加油酸相对含量、快速降低肠杆菌数;使用正交偏最小二乘判别分析建立模型,结合变量投影重要性(variable importance projection,VIP)值筛选出17种差异挥发性风味物质(VIP>1),可以对不同比例酿酒酵母Y-8与植物乳植杆菌Z43复配发酵香肠做出很好地区分;植物乳植杆菌Z43与酿酒酵母Y-8以20∶1(植物乳植杆菌Z43接种量为107 CFU/g)比例复配发酵香肠感官综合评分最高、色度值最大,硬度显著高于其他组(P<0.05),且3-羟基-2-丁酮含量明显高于其余3组;接种酿酒酵母Y-8可以赋予发酵香肠浓郁的醇香和酯香、有效祛除酸味、提高发酵香肠的品质和安全性,此结果可为酿酒酵母在发酵肉制品中的应用提供参考。

关键词：酿酒酵母发酵香肠挥发性风味物质脂肪酸

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QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中47种农药残留

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食品工业科技 2024年第9期45卷 255-264页

作者：刘华文邓美晴陈北燕广西-东盟食品检验检测中心广西南宁530029 广西医科大学公共卫生学院广西南宁530022 南宁市卫生学校广西南宁530409

建立一种QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶叶中47种农药残留的分析方法。样品经1%乙酸乙腈提取,QuEChERS方法净化,配有电喷雾离子源(ESI±)的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS),在正负离子多反应监测(MRM)模式下同时测... 详细信息

建立一种QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶叶中47种农药残留的分析方法。样品经1%乙酸乙腈提取,QuEChERS方法净化,配有电喷雾离子源(ESI±)的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS),在正负离子多反应监测(MRM)模式下同时测定,基质匹配外标法定量。结果表明:47种目标化合物在一定范围内线性关系良好,相关系数(r)为0.9971~0.9996,检出限为0.001~0.006 mg/kg,定量限为0.002~0.020 mg/kg,平均回收率为73.4%~114.3%,相对标准偏差(n=6)为0.3%~19.9%。该方法灵敏、准确、稳定,可满足茶叶中47种农药残留的检测要求。

关键词： QuEChERS 茶叶农药残留超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)

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网络虚拟消费调查研究

统计学与应用 2024年第3期13卷 688-695页

作者：唐佳媛邓淇北方工业大学理学院北京

互联网的快速发展引起消费主义的内容和形态发生变化,在网络空间呈现较为明显的虚拟化趋向。本文通过对网络虚拟消费的认知程度进行调研,运用SPSS软件,对问卷进行简单的描述性分析,且采用T检验与单因素ANOVA检验和多元回归分析,通过实... 详细信息

互联网的快速发展引起消费主义的内容和形态发生变化,在网络空间呈现较为明显的虚拟化趋向。本文通过对网络虚拟消费的认知程度进行调研,运用SPSS软件,对问卷进行简单的描述性分析,且采用T检验与单因素ANOVA检验和多元回归分析,通过实证分析设计出网络虚拟消费认识量表,分析了调研对象对虚拟购物消费的认知水平,并得出相应的性别差异与年龄差异对认知水平有影响,以及不同自变量对于网络虚拟消费意愿的多元表达式,据此提出相应的对策与建议。

关键词：网络虚拟消费多元回归分析认知水平 T检验和单因素方差分析

应力作用下岩石介质两相流束缚流体饱和度分形预测模型研究

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岩土工程学报 2024年第4期46卷 871-879页

作者：赵明凯孔德森滕森邓美旭山东科技大学土木工程与建筑学院山东青岛266590 山东科技大学山东省土木工程防灾减灾重点实验室山东青岛266590

束缚流体饱和度是预测两相流中相对渗透率的重要参数,在油气藏开发等工程领域有着重要作用。为此,基于分形理论和毛细管模型,首先将岩石等效为固体团簇的集合体,引入不同分形维数分别表征固体团簇的尺度分布特征和流动路径的迂曲性,然... 详细信息

束缚流体饱和度是预测两相流中相对渗透率的重要参数,在油气藏开发等工程领域有着重要作用。为此,基于分形理论和毛细管模型,首先将岩石等效为固体团簇的集合体,引入不同分形维数分别表征固体团簇的尺度分布特征和流动路径的迂曲性,然后提出了一种预测束缚流体在应力作用下的饱和度模型,并使用试验数据进行了验证,最后分析了束缚流体饱和度的应力敏感性和模型中各参数的影响机制。结果表明:束缚流体饱和度与流体黏度、孔隙结构参数、压降梯度以及弹性模量密切相关,有效应力会增大束缚流体饱和度,分形维数可以反映束缚流体形成的流体膜厚度和实际流动长度,量化了孔隙结构特征对束缚流体饱和度的影响。

关键词：岩石分形两相流有效应力束缚流体饱和度

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植物乳杆菌及模仿葡萄球菌对发酵鱼肉糜质构及持水力的影响

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食品与发酵工业 2024年

作者：纪锡伟卢涵张香美范鑫洋刘程鹏车淇河北经贸大学生物科学与工程学院河北科技大学食品与生物学院

为进一步了解发酵鱼肉糜蛋白理化特性与质构、持水力之间的相关性，提高发酵鱼肉糜质量提供理论依据，该文测定了接种植物乳杆菌及模仿葡萄球菌后鲤鱼鱼肉糜在发酵及干燥后熟期间pH、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-... 详细信息

为进一步了解发酵鱼肉糜蛋白理化特性与质构、持水力之间的相关性，提高发酵鱼肉糜质量提供理论依据，该文测定了接种植物乳杆菌及模仿葡萄球菌后鲤鱼鱼肉糜在发酵及干燥后熟期间pH、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）、SDS-PAGE、肌原纤维蛋白的总巯基及二硫键含量、硫代巴比妥酸反应物值（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）、表面疏水性、质构（硬度、弹性、胶着性、咀嚼性）及持水力（离心损失）随时间的变化，并与自然发酵进行比较。结果发现在发酵及干燥后熟期间，接种发酵组鱼肉糜的pH、TBARS、TVB-N值显著低于自然发酵组，SDS-PAGE结果显示接种发酵组的肌球蛋白重链降解程度低于自然发酵组，而肌原纤维蛋白的总巯基、二硫键含量以及表面疏水性显著高于自然发酵组，同时接种发酵组鱼肉糜具有较高的硬度、咀嚼性和胶着性以及较低的离心损失。这说明接种发酵能够抑制鱼肉糜的蛋白氧化、降解及脂肪酸败，提高其蛋白的表面疏水性和二硫键含量，从而提升发酵鱼肉糜的质构及持水力。

关键词：鲤鱼鱼肉糜接种发酵蛋白质构持水力

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石斛兰新品种‘旭日’

园艺学报 2024年第S1期 173-174页

作者：韦妙琴沈丽娟张磊苏大宏邓淇云粟智勇罗清南宁植物园南宁青秀山风景名胜旅游开发有限责任公司广西壮族自治区亚热带作物研究所

‘旭日’石斛兰是以曲茎石斛（Dendrobium flexicaule）为母本，细茎石斛（Den. moniliforme）为父本杂交育成的新品种。株高中等，假鳞茎具紫色斑点，花朵浅黄色，唇瓣中部有橙红色胼胝体。具有较强的耐热性和适应性，适于华南地区温... 详细信息

‘旭日’石斛兰是以曲茎石斛（Dendrobium flexicaule）为母本，细茎石斛（Den. moniliforme）为父本杂交育成的新品种。株高中等，假鳞茎具紫色斑点，花朵浅黄色，唇瓣中部有橙红色胼胝体。具有较强的耐热性和适应性，适于华南地区温室或户外附生栽培。

关键词：石斛兰杂交品种