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PD-1/PD-L1的表达纯化及特异性标记的研究

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PD-1/PD-L1的表达纯化及特异性标记的研究

作者：邓文月天津大学

学位级别：硕士

癌症是威胁人类生命健康的重大疾病,治愈癌症依然任重而道远。目前免疫疗法在治疗癌症方面体现出越来越多的优势,其中免疫检查点抑制剂的开发和应用在临床上取得了重要突破。PD-1/PD-L1是一组免疫检查点,PD-1蛋白通常在T细胞的表面表达,... 详细信息

癌症是威胁人类生命健康的重大疾病,治愈癌症依然任重而道远。目前免疫疗法在治疗癌症方面体现出越来越多的优势,其中免疫检查点抑制剂的开发和应用在临床上取得了重要突破。PD-1/PD-L1是一组免疫检查点,PD-1蛋白通常在T细胞的表面表达,PD-L1蛋白一般是在癌细胞的表面表达,当PD-1与PD-L1相互作用时,会导致T细胞丧失免疫功能,无法杀伤肿瘤细胞,导致肿瘤细胞免疫逃逸。目前,抑制PD-1与PD-L1相互作用的单克隆抗体药物在肿瘤免疫治疗中取得了显著效果,但单克隆抗体分子量大、稳定性差、成本高昂,且同其他肿瘤药物一样存在耐药性问题。而纳米抗体分子量小、结构稳定、组织渗透性强,便于开发双特异性抗体。因此开发靶向PD-1/PD-L1的纳米抗体有较大的研究价值。本研究在于探讨PD-1/PD-L1蛋白的表达纯化及特异性标记,以便为后续纳米抗体的开发奠定技术基础。研究中我们发现PD-1/PD-L1蛋白以包涵体形式表达,因此我们通过对包涵体中表达的PD-1/PD-L1的变性复性条件的优化,探索出两种复性方法,一种是梯度透析复性,一种是逐滴稀释复性。这两种方法能够有效使蛋白正确折叠。之后我们利用Sortase酶和合成的FITC-LPETGG、Biotin-LPETGG、Biotin-A-(K)-FITC-ALPETGG等多肽对纯化的PD-1/PD-L1进行了标记。此外,我们还尝试在PD-1的C端加上AVI标签,以便使PD-1在生物合成过程中被生物素化。利用标记的PD-1/PD-L1蛋白和哺乳动物细胞表面展示的PD-L1/PD-1,我们建立了流式细胞检测方法以验证标记的PD-1/PD-L1的生物学功能。经验证,加入AVI标签的PD-1可被生物素化,并与细胞表面展示的PD-L1结合;同时,经Biotin-A-(K)-FITC-ALPETGG标记的PD-L1亦可与细胞表面展示的PD-1结合。因此,本实验完成了PD-1/PD-L1的表达纯化及特异性标记,并建立了可用于检测PD-1/PD-L1生物学功能的流式细胞检测方法,为后续开展纳米抗体的筛选打下了坚实的基础。

关键词： PD-1 PD-L1 包涵体蛋白标记活性鉴定

长链非编码RNA CRNDE在人脑胶质瘤中的表达及其临床意义的研究

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长链非编码RNA CRNDE在人脑胶质瘤中的表达及其临床意义的研究

作者：邓文月河北医科大学

学位级别：硕士

目的:脑胶质瘤是多种因素和多类基因相互作用后逐步发展的结果,但它具体的发生和发展机制仍是一个谜团。长链非编码RNA(Lnc RNA)是构成人类基因组中重要的组成部分,虽然其序列上缺乏开放读码框(OFR),不能直接表达蛋白,但它在转录前后以... 详细信息

目的:脑胶质瘤是多种因素和多类基因相互作用后逐步发展的结果,但它具体的发生和发展机制仍是一个谜团。长链非编码RNA(Lnc RNA)是构成人类基因组中重要的组成部分,虽然其序列上缺乏开放读码框(OFR),不能直接表达蛋白,但它在转录前后以及表观遗传学等多个环节对靶基因进行精准的调控。他通过间接干预基因的表达从而影响到整个生物学的功能。大量研究分析表明,Lnc RNA的异常表达与人类肿瘤的发生、演变有着紧密的关联,而且与肿瘤恶性分化程度以及预后相关。CRNDE是结肠癌差异表达长链非编码RNA,此基因存在于人染色体的反义链上,全长约10kb,具有5个核心外显子和一个附加外显子。它在宫颈癌和直肠癌组织中的表达均明显高于癌旁组织。这种表达差异在脑胶质瘤中是否成立呢?本实验围绕脑胶质瘤组织与瘤旁组织,有关CRDNE表达水平是否存在差异以及CRNDE与肿瘤临床病理学的关联展开研究,通过对两组病人进行长期随访后,获取他们的生存时间并纳入生存分析。其结果可以为脑胶质瘤病的诊断、治疗及预后评估开辟一条新的道路。方法:1收集自2007年至2012年,河北医科大学第二医院手术室,神经外科手术当中取出的胶质瘤标本。经过我们仔细的核查后确认,全部的患者均未曾在术前接受过放射治疗及化学药物治疗。留取进行实验的组织均由病理科鉴定,存储在冻存管内并及时将管放入液氮罐内保存。所收集的80例脑胶质瘤标本参照2007世界卫生组织对中枢神经系统(WHO-CNS)肿瘤的分类标准,其中低级别组42例,高级别组38例。此外,在脑胶质瘤手术当中,收集20例手术入路中显微镜下距瘤组织边缘1cm以内的正常脑组织标本(使用术中导航确定肿瘤边界)作为对照组,收集方法与收集胶质瘤组织一致。2使用实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)方法,获取瘤旁组织与脑胶质瘤组织的CRNDE表达量,并对两者进行比较。采用卡方检验验证CRNDE表达水平与临床病理特征的关系。经过长期随访,获得脑胶质瘤病人的生存时间,采用Kapaln-Meier生存分析,绘制两组患者的生存曲线并对两条曲线进行比较,生存时间从患者手术之日算起,到其死亡或者是末次随访日所经历的时间,单位按月来计数。探索CRNDE表达水平的高低与患者五年生存率的关系。结果:1对比脑胶质瘤组织与瘤旁组织的CRNDE表达水平,脑胶质瘤组织中CRNDE的最后Ct均值为3.89±0.19,瘤旁组织CRNDE的最后Ct的均值为1.00±0.04,因此可以看出,CRNDE在脑胶质瘤的表达水平明显高于瘤旁组织CRNDE的表达水平。对比高级别脑胶质瘤CRNDE的表达水平与低级别组CRNDE的表达水平,可发现高级别肿瘤CRNDE的最后Ct的均值为4.33±0.40,低级别脑胶质瘤CRNDE的最后Ct均值为1.87±0.18,由此可知,高级别脑胶质瘤组织当中CRNDE的表达水平明显高于低级别组。(见图1、图2、表1、表2)2对CRNDE的表达水平与患者年龄、性别、发病形式、肿瘤大小、是否存在坏死、WHO级别、肿瘤的复发,多种临床因素进行比较,使用卡方检验进行分析后表明,CRNDE的表达与肿瘤的复发(P=0.010)、肿瘤的大小(P=0.026)、WHO分级(P=0.003)有关,与年龄(P=0.358)、性别(P=0.204)、发病形式(P=0.171)、是否存在坏死(P=0.367)无关。(见表3)3本组资料中,我们根据CRNDE表达量选取中位表达量来划分高表达组和低表达组。使用Kaplan-Meier进行生存分析显示,高表达组患者的生存时间较低表达组患者明显缩短。比较两者的一年生存率显示:高表达组患者一年生存率为84.4%,低表达组患者一年生存率为97.1%,两者比较有显著差异(P<0.05)。比较两组患者五年生存率,发现CRNDE高表达组的脑胶质瘤患者五年生存率仅为15.6%,低表达组患者五年的生存率为37.1%。两者比较有显著差异(P<0.05)。(见图3)结论:1在脑胶质瘤组织与瘤旁组织有关CRNDE表达水平的对比中,以及高级别的脑胶质瘤与低级别的脑胶质瘤关于CRNDE表达水平的比较中,我们可以发现CRNDE在脑胶质瘤组织中的表达明显高于瘤旁组织中的表达,且CRNDE的表达水平与WHO分级有关,高级别的脑胶质瘤CRNDE表达水平明显高于低级组。2脑胶质瘤中CRNDE表达水平与肿瘤的大小、WHO分级以及肿瘤是否复发有关,与年龄、性别、发病形式、是否存在坏死因素无关。3脑胶质瘤中CRNDE表达水平越高,往往相同时间内其患者生存率越低,且CRNDE高表达组的患者五年生存率明显小于低表达组。

关键词：脑胶质瘤 CRNDE q RT-PCR 生存分析生存率

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纳米抗体特性及其在冠状病毒研究中的应用

生物技术 2022年第1期32卷 126-133页

作者：邓文月张维达孙慧敏于海波天津大学生命科学学院天津300072

纳米抗体分子量小、结构稳定、溶解度高、易于编辑、组织穿透性强等,已经成为开发复杂纳米生物技术的理想研究工具,被应用于生物医学和生物技术领域,在监测分子、免疫成像、疾病治疗等方面有巨大的作用,在冠状病毒研究领域能够用于抑制... 详细信息

纳米抗体分子量小、结构稳定、溶解度高、易于编辑、组织穿透性强等,已经成为开发复杂纳米生物技术的理想研究工具,被应用于生物医学和生物技术领域,在监测分子、免疫成像、疾病治疗等方面有巨大的作用,在冠状病毒研究领域能够用于抑制受体和冠状病毒刺突蛋白受体结合域的相互作用,成为治疗新型冠状病毒肺炎的潜在药物,同时也作为一种检测工具,监测人体免疫情况。该文综述了纳米抗体的结构、功能特性及其在生物技术领域和冠状病毒领域的研究进展,并对其在生物技术和临床方面的应用前景进行了展望。

关键词：纳米抗体新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域

LncRNA CRNDE对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响

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中华小儿外科杂志 2018年第5期39卷 351-355页

作者：邓文月景世元索庆丽龚瑞龙路营营刘峰华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院神经外科武汉430016

目的探讨LncRNA CRNDE对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响.方法将CRNDE基因干扰siRNA转染人胶质瘤U251细胞株,并同时设置空白组及对照组,利用PE AnnexinV-FITC染色,CCK-8实验以及细胞迁移实验分析LncRNA CRNDE对脑胶质瘤细胞凋亡... 详细信息

目的探讨LncRNA CRNDE对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响.方法将CRNDE基因干扰siRNA转染人胶质瘤U251细胞株,并同时设置空白组及对照组,利用PE AnnexinV-FITC染色,CCK-8实验以及细胞迁移实验分析LncRNA CRNDE对脑胶质瘤细胞凋亡、增殖及迁移的影响.结果转染12h RNA干扰组（si783、si809）与对照组细胞480nm处吸光度的差异有统计学意义（P＜0.05）,与空白组之间差异无统计学意义（P＞0.05）;转染24 h及48 h干扰组（si783、si809）细胞480 nm处吸光度显著低于对照组和空白组（P＜0.05）;siRNA（si783、si809）的U251细胞凋亡比例分别为20.2％、19.3％,明显高于空白对照组（3.8％）及转染对照siRNA组（4.6％）（P＜0.05）,空白对照组与转染对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）.转染后干扰组（si783、si809）的细胞计数分别为（287.2±28.6）和（351.6±16.9）,均低于空白组（518.2±29.9）和对照组（471.6±29.4）（P＜0.05）,空白组与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 CRNDE可促进胶质瘤细胞增殖及迁移,抑制胶质瘤细胞凋亡.

关键词：神经胶质瘤细胞增殖细胞凋亡细胞迁移分析结直肠癌差异表达长链非编码RNA

栀子(Gardenia jasminoides)GGPPS基因小亚基的克隆及表达分析

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分子植物育种 2020年第10期18卷 3199-3206页

作者：陈建荣毛凯权陈果刘芷翾邓文月刘芳长沙学院生物与环境工程学院长沙410022

香叶基焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)是单萜的前体物质,而单萜是栀子内重要的活性成分。香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)在萜类化合物、类胡萝卜素类化合物生物合成中处于关键位置,GGPPS主要分为香叶基香叶基焦磷酸合成酶大亚基(GGP... 详细信息

香叶基焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)是单萜的前体物质,而单萜是栀子内重要的活性成分。香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)在萜类化合物、类胡萝卜素类化合物生物合成中处于关键位置,GGPPS主要分为香叶基香叶基焦磷酸合成酶大亚基(GGPPSlsu)和香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基(GGPPSssu)。为了研究栀子GGPPS基因在栀子萜类生物合成中的作用,本研究成功从栀子品种‘林海一号’中提取RNA反转录合成cDNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到栀子GGPPSssu的cDNA序列,分别命名为GjGGPPSssu1和GjGGPPSssu2,ORF区分别为1053 bp和915 bp。通过构建基因进化树,栀子GGPPSssu基因和其他植物的GGPPSssu基因聚为一类,属于香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基基因。通过蛋白质序列比对表明GjGGPPSssu1有一个CxxxC(x为碱性氨基酸)的保守基元和一个FARM的保守基元,没有SARM保守基元,与SSUⅡ类基因相似;GjGGPPSssu2有两个CxxxC的保守基元,没有FARM保守基元和SARM保守基元,与SSUⅠ类基因相似。荧光定量PCR试验结果表明,GjGGPPSssu1在T4和T5时期有较高的表达水平,GjGGPPSssu2在栀子各生长时期的根部和果实中有较高水平的表达。推测GjGGPPSssu1基因与栀子黄色素合成相关,GjGGPPSssu2基因与单萜合成相关。本研究初步解析了栀子GGPPS基因的功能,为提高栀子药用品质提供了理论依据。

关键词：栀子(Gardenia jasminoides) 基因克隆香叶基香叶基焦磷酸合酶小亚基荧光定量

Ommaya囊在低龄颅后窝肿瘤术后脑积水中的应用

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中国临床神经外科杂志 2021年第5期26卷 365-366页

作者：汤伟何远志黄玲月路营营邓文月马盼杜浩中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院神经外科武汉430016

目的探讨Ommaya囊在低龄(<3岁)颅后窝肿瘤术后脑积水中的应用效果。方法回顾性分析2018年12月至2019年12月收治的7例低龄颅后窝肿瘤术后合并脑积水患儿的临床资料。7例均采用置入Ommaya囊的方法治疗脑积水,并随访3个月。结果7例患儿在置... 详细信息

目的探讨Ommaya囊在低龄(月至2019年12月收治的7例低龄颅后窝肿瘤术后合并脑积水患儿的临床资料。7例均采用置入Ommaya囊的方法治疗脑积水,并随访3个月。结果7例患儿在置入Ommaya囊后,通过间断穿刺抽液,脑积水症状均缓解,其中1例1个月后改为脑室-腹腔分流术并取出Ommaya储液囊。2例术后皮下积液通过Ommaya囊穿刺抽液治愈。结论对于低龄颅后窝肿瘤术后脑积水,Ommaya囊置入术是一种安全、有效并可降低术后并发症的治疗方法。

关键词：颅后窝肿瘤脑积水 Ommaya囊低龄儿童

下调CRNDE基因表达对MAPK/ERK通路中相关基因的影响

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临床神经外科杂志 2019年第4期16卷 294-297,302页

作者：邓文月杜浩何远志黄玲玥路营营汤伟景世元华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院神经外科

目的探讨下调LncRNA CRNDE基因表达对MAPK/ERK通路及转录因子中相关基因的影响。方法将CRNDE基因干扰siRNA 转染人胶质瘤 U251细胞系,并同时设置空白组及对照组,利用实时PCR检测细胞系中MAPK/ERK通路及转录因子中相关基因表达量的变... 详细信息

目的探讨下调LncRNA CRNDE基因表达对MAPK/ERK通路及转录因子中相关基因的影响。方法将CRNDE基因干扰siRNA 转染人胶质瘤 U251细胞系,并同时设置空白组及对照组,利用实时PCR检测细胞系中MAPK/ERK通路及转录因子中相关基因表达量的变化。结果与空白组及对照组相比,转染组(si783、si809)中相关基因NF-κB、MEK2、ERK1、ERK2、c-Myc、Raf-1表达量均明显下降(均P <0.05),具有统计学意义。结论 CRNDE可能通过调节MAPK/ERK通路中及转录因子中一系列相关基因表达,增加胶质瘤细胞的增殖和迁移能力,同时抑制细胞凋亡。

关键词：结直肠癌差异表达长链非编码RNA MAPK/ERK通路增殖凋亡迁移

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乳头状瘤型脑膜瘤1例报告并文献复习

临床神经外科杂志 2020年第3期17卷 357-360页

作者：路营营杜浩黄玲玥何远志邓文月战伟萍华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院神经外科武汉430016 莱州市妇幼保健院儿科

目的探讨乳头状瘤型脑膜瘤的临床、影像及病理学特征。方法对1例乳头状瘤型脑膜瘤患儿的临床表现、影像学及病理免疫组织化学染色结果进行分析;并对相关文献进行复习。结果本例患儿,男,1岁11个月;主诉间断意识丧失伴呕吐1周入院。头颅MR... 详细信息

目的探讨乳头状瘤型脑膜瘤的临床、影像及病理学特征。方法对1例乳头状瘤型脑膜瘤患儿的临床表现、影像学及病理免疫组织化学染色结果进行分析;并对相关文献进行复习。结果本例患儿,男,1岁11个月;主诉间断意识丧失伴呕吐1周入院。头颅MRI增强扫描示,右侧顶枕部囊实性占位,基底池周围脑膜明显异常强化。行手术切除肿瘤。组织病理学检查可见:肿瘤分界不清,肿瘤细胞大小不等,细胞核圆形、椭圆形或长梭形,部分核内可见假包涵体,核分裂像多见,核仁不明显,胞浆红染,可见少量瘤巨细胞;部分瘤细胞密集排列,部分区域瘤细胞围绕血管,呈假菊形团。免疫组化染色:EMA(+),S-100(+),CD99(+),Ki-67(+)抗原标记指数为10%,PGP9.5(+),NF(-),GFAP(-),NeuN(-)。结论乳头状瘤型脑膜瘤临床少见,恶性程度高,预后不良;影像学及肿瘤标志物有一定的特征性表现,诊断需要根据病理形态学特点确定。

关键词：乳头状瘤型脑膜瘤免疫组织化学病理学

不同内镜评分法评估儿童克罗恩病疾病活动度的价值

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中国当代儿科杂志 2024年第6期26卷 584-591页

作者：邓文李中跃刘波重庆医科大学附属儿童医院消化科/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地/儿科学重庆市重点实验室重庆400014 浙江大学医学院附属第四医院儿科浙江义乌322000

目的探讨不同内镜评分法在评估儿童克罗恩病(Crohn's disease,CD)疾病活动度中的价值。方法收集2018年1月—2023年1月于重庆医科大学附属儿童医院明确诊断的CD患儿70例,根据儿童克罗恩病活动指数(Pediatric Crohn's Disease Activity ... 详细信息

目的探讨不同内镜评分法在评估儿童克罗恩病(Crohn's disease,CD)疾病活动度中的价值。方法收集2018年1月—2023年1月于重庆医科大学附属儿童医院明确诊断的CD患儿70例,根据儿童克罗恩病活动指数(Pediatric Crohn's Disease Activity Index,PCDAI)对患儿进行临床疾病活动度评分,根据内镜下表现进行内镜镜评分。采用Spearman秩相关分析评价各内镜评分方法与PCDAI及实验室指标之间的相关性,采用Kappa检验评价结肠镜及胶囊内镜评分法与PCDAI判断CD活动度的一致性,采用受试者操作特征曲线分析实验室指标预测内镜下活动度的诊断效能。结果 PCDAI得分与克罗恩病内镜下严重程度指数(Crohn's Disease Endoscopic Index of Severity,CDEIS)得分(r_s=0.696,P<0.01)、克罗恩病简化内镜评分(Simple Endoscopic Score for Crohn's Disease,SES-CD)得分(r_s=0.680,P<0.01)、Lewis评分得分(r_s=0.540,P<0.01)及胶囊内镜克罗恩病指数(Capsule Endoscopy-Crohn's Disease Index,CE-CD)得分(r_s=0.502,P<0.01)均呈中度正相关。所有内镜评分法与PCDAI在判断CD活动度中的一致性较差(Kappa=0.069~0.226)。红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、血细胞比容(hematocrit,HCT)、血清白蛋白(serum albumin,ALB)水平与PCDAI得分、结肠镜评分法(CDEIS、SES-CD)得分均呈中度相关(|r_s|=0.581~0.725,P<0.01),与各胶囊内镜评分法得分相关性弱(P<0.05)。ESR、CRP预测PCDAI、CDEIS、SES-CD、Lewis评分下CD疾病活动的曲线下面积高于HCT、ALB (P<0.05)。结论内镜评分法中CDEIS、SES-CD、Lewis评分、CE-CD可用于评估儿童CD是否存在疾病活动,但与PCDAI评估下的疾病活动度不完全一致。ESR、CRP水平升高可预测临床及内镜下儿童CD疾病活动。

关键词：克罗恩病内镜评分克罗恩疾病活动度儿童