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赤羽病病毒和施马伦贝格病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

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中国动物传染病学报 2023年

作者：邓俊花陈冬杰魏方王晶晶吕继洲吴绍强中国检验检疫科学研究院

为建立一种能够同时检测赤羽病病毒（AKAV）和施马伦贝格病毒（SBV）的方法，本研究以AKAV和SBV的S基因为靶基因，设计其通用引物和特异性探针，通过优化反应条件，建立了AKAV和SBV双重荧光RT-PCR检测方法，并对其特异性、敏感性及重复... 详细信息

为建立一种能够同时检测赤羽病病毒（AKAV）和施马伦贝格病毒（SBV）的方法，本研究以AKAV和SBV的S基因为靶基因，设计其通用引物和特异性探针，通过优化反应条件，建立了AKAV和SBV双重荧光RT-PCR检测方法，并对其特异性、敏感性及重复性进行检验。同时，评估其临床应用效果。结果显示，该方法AKAV以及SBV最低检测线均可达1.5 copies/μL；与牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒均无交叉反应，具有良好的特异性；50份临床样品检测结果与AKAV、SBV行业标准推荐方法符合率为100%。本研究建立的双重荧光RT-PCR方法，适用于AKAV和SBV的临床检测，为该病疫情防控提供了新的筛查手段。

关键词：赤羽病病毒施马伦贝格病毒双重荧光RT-PCR 应用

赤羽病病毒Gc aa465~704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

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中国兽医杂志 2023年第12期59卷 49-53页

作者：魏方陈冬杰邓俊花王晶晶吴绍强中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所北京亦庄100176

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465~704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc aa465~704蛋白,纯化后... 详细信息

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465~704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc aa465~704蛋白,纯化后免疫小鼠;通过细胞融合和亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞,利用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)对mAb特性进行鉴定。结果显示,本试验成功筛选出1株可稳定分泌抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb的杂交瘤细胞株4D1,Western blot结果显示,mAb 4D1可特异性识别AKAV Gc aa465~704蛋白;IFA结果显示,mAb 4D1能够与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。结果表明,本试验成功制备抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb,为进一步研究AKAV Gc蛋白生物学功能和建立AKAV检测方法提供技术支持。

关键词：赤羽病病毒 Gc蛋白杆状病毒表达单克隆抗体

针药结合治疗原发性干燥综合征109例眼干症状增效研究

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针药结合治疗原发性干燥综合征109例眼干症状增效研究

作者：邓俊花安徽中医药大学

学位级别：硕士

1目的对比研究针刺结合路氏润燥汤与单用路氏润燥汤对治疗原发性干燥综合征眼干症状的疗效及安全性,评价合用针刺对路氏润燥汤治疗原发性干燥综合征患者眼干症状的增效作用。2方法采用前瞻、单盲、随机、对照性试验研究方法,共收纳符合... 详细信息

1目的对比研究针刺结合路氏润燥汤与单用路氏润燥汤对治疗原发性干燥综合征眼干症状的疗效及安全性,评价合用针刺对路氏润燥汤治疗原发性干燥综合征患者眼干症状的增效作用。2方法采用前瞻、单盲、随机、对照性试验研究方法,共收纳符合纳入标准的原发性干燥综合征患者116例,随机分为两组,对照组给予路氏润燥汤加减治疗,治疗组在对照的基础上加用针刺疗法。研究周期为12周,分别在0周,及用药后的1、2、3、4、6、8、10、12周安排访视,对两组中医眼干、口干、乏力症状,西医眼干VAS、口干VAS、乏力VAS及中医整体证候进行评分;在0、12周做吸墨试验检查、疗前疗后实验室指标检查及用药期间安全性检查。研究完成后分别采用症状评价与疗效评价,对两组内、组间各项指标进行分析,得出组内疗前疗后差异,组间差异。3结果(1)整体证候:12周治疗后,单用路氏润燥汤治疗中医整体证候的有效率为79.63%,加用针刺治疗有效率高达89.66%。(2)眼干症状:在治疗12周后,单用路氏润燥汤治疗中医眼干症状的有效率为57.41%,加用针刺治疗有效率为72.73%;单用路氏润燥汤治疗眼干VAS的有效率为59.26%,加用针刺治疗有效率为83.64%;而两组吸墨试验结果也都较疗前有明显改善,泪液分泌有增加。(3)其它症状:两组治疗对患者中医证候口干症状、及西医口干VAS评分改变均有改善作用,且治疗组西医口干VAS评分在各评价点均值均低于对照组。两组治疗对患者中医乏力症状、西医乏力VAS评分改变均有改善作用。(4)免疫学指标:12周疗程结束后,两组ESR、RF、Ig G都明显下降,但两组间比较无差异。(5)安全性:治疗组各项安全指标疗前疗后无异常,对照组12周疗后,出现1例白细胞减少,继续原方治疗一个月,复查结果正常,考虑是本病特点所致白细胞减少。4结论单用路氏润燥汤治疗原发性干燥综合征已经达到很好的治疗效果,但当针刺合用路氏润燥汤时,疗效率又明显升高。针药结合治疗p SS眼干症状优于单用中药,说明中医综合疗法治疗本病的优势,加用针刺使方药的治疗更上一个高度。两种疗法,对免疫学指标均有一定改变作用,但不明显。临床上应该针药结合治疗p SS眼干症,可提高疗效,同时副作用小、安全可靠、又减少患者长期用药经济负担,值得广泛推广。

关键词：针刺疗法路氏润燥汤原发性干燥综合征眼干增效

非洲猪瘟病毒MGF-505R基因缺失株双重荧光RPA检测方法的建立及应用

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畜牧与兽医 2023年第12期55卷 85-90页

作者：邓俊花吕继洲陈冬杰袁向芬魏方赵文军吴绍强中国检验检疫科学研究院北京100176 三亚中国检科院生物安全中心海南三亚572025

旨在建立一种快速现场筛查非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株的方法,以便鉴别我国复杂的ASFV感染情况。通过分析国内ASFV流行态势,选择MGF-505R基因及B646L基因,设计特异性引物及exo探针,对其进行敏感性、特异性分析,并进行临床应用。利用双... 详细信息

旨在建立一种快速现场筛查非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株的方法,以便鉴别我国复杂的ASFV感染情况。通过分析国内ASFV流行态势,选择MGF-505R基因及B646L基因,设计特异性引物及exo探针,对其进行敏感性、特异性分析,并进行临床应用。利用双重-重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测ASFV MGF-505R及B646L基因,结果显示:检测时间在15 min内,最低检测限均为10 copies/反应,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;利用所建立方法对266份临床样品进行检测,结果与世界动物卫生组织(WOAH)推荐荧光PCR检测方法的符合率为100%。建立的ASFV MGF-505R基因缺失株的荧光RPA检测方法适配可移动式荧光RPA检测仪,具有快速、灵敏度高、特异性强的优点,适用于ASFV现场快速临床检测,为非洲猪瘟疫情防控提供一种新的筛查手段。

关键词：非洲猪瘟 MGF-505R基因 B646L基因双重荧光RPA 应用

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轮状病毒套式PCR方法的建立

黑龙江畜牧兽医 2007年第12期 89-90页

作者：邓俊花单虎莱阳农学院动物科技学院山东青岛266109

轮状病毒(Rotavirus,RV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属.现已证实RV是婴幼儿和各种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一.猪RV在无其他病原存在的实验条件下可引起悉生猪和未食初乳的猪发生严重的胃肠炎和绒毛萎缩.RV的基因组由11... 详细信息

轮状病毒(Rotavirus,RV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属.现已证实RV是婴幼儿和各种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一.猪RV在无其他病原存在的实验条件下可引起悉生猪和未食初乳的猪发生严重的胃肠炎和绒毛萎缩.RV的基因组由11节段的双股RNA组成.所有的11个节段都有同样的末端结构,具有5'm'GPPPPGm,3'末端无Poly(A)尾,单一长开放阅读框架(open readingframe,ORF'),缺乏聚腺苷酸序列.ORF两端为5'和3'端的非编码区(5'-and 3'-terminal untranslated regions,UTRs).

关键词：轮状病毒 PCR方法呼肠孤病毒科病毒性腹泻幼龄动物实验条件婴幼儿胃肠炎

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猪瘟病毒装甲RNA颗粒质控品的研制及评估

养殖与饲料 2023年第8期22卷 1-5页

作者：邓俊花陈冬杰魏方吴绍强中国检验检疫科学研究院北京100176

[目的]研制一种安全稳定高效的猪瘟核酸检测质控品,为猪瘟疫病监测提供技术支持。[方法]将猪瘟病毒核酸检测靶基因构入至新型装甲RNA表达载体pTMACC,转化、表达并纯化,制备猪瘟病毒装甲RNA质控品。借助电泳、电镜、动态散射分析鉴定该... 详细信息

[目的]研制一种安全稳定高效的猪瘟核酸检测质控品,为猪瘟疫病监测提供技术支持。[方法]将猪瘟病毒核酸检测靶基因构入至新型装甲RNA表达载体pTMACC,转化、表达并纯化,制备猪瘟病毒装甲RNA质控品。借助电泳、电镜、动态散射分析鉴定该物质结构特性,并对其均匀性、稳定性进行分析,评估其实用性能。[结果]该装甲RNA颗粒含有猪瘟病毒特异性基因,序列溯源至法国Thiverval株;为RNA-蛋白复合物,颗粒呈直径约26 nm的多边形;该质控品均匀、稳定,-20℃至少稳定保存36个月;经8家权威实验室性能评估,该物质可以作为猪瘟病毒核酸检测质控品。[结论]猪瘟病毒装甲RNA质控品均匀性良好,稳定性强,无生物传染性,核酸RNA不易降解,可稳定保存,进一步保障猪瘟疫病的临床检测的准确性。

关键词：猪瘟病毒装甲RNA颗粒核酸检测质控品

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猪制品中非洲猪瘟病毒核酸提取方法的比较

中国动物检疫 2023年第5期40卷 97-101页

作者：邓俊花梅琳吕继洲李昊轩吴绍强中国检验检疫科学研究院北京100176

为比较猪制品中非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸提取效率,将非洲猪瘟假病毒掺入新鲜猪肉、香肠、血粉试验材料,制备相关模拟感染样品,然后采用核酸免抽提、柱式核酸提取及磁珠吸附核酸提取方法提取ASFV核酸,计算ASFV核酸回收率,评估提取效率。... 详细信息

为比较猪制品中非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸提取效率,将非洲猪瘟假病毒掺入新鲜猪肉、香肠、血粉试验材料,制备相关模拟感染样品,然后采用核酸免抽提、柱式核酸提取及磁珠吸附核酸提取方法提取ASFV核酸,计算ASFV核酸回收率,评估提取效率。结果显示:猪制品模拟感染样品中,ASFV核酸在上清和沉淀中均被检出,且上清中的检出量高于沉淀;对于香肠模拟感染样品上清,3种核酸提取方法均适合,但以柱式提取方法为佳,病毒回收率高达82.8%;对于新鲜猪肉模拟感染样品上清,以磁珠吸附核酸提取方法为佳,病毒回收率为20.9%;对于血粉模拟感染样品上清,以柱式核酸提取方法为佳,病毒回收率为10.2%。本研究为不同猪制品中ASFV核酸提取提供了参考。

关键词：非洲猪瘟病毒猪制品核酸提取回收率比较分析

钝缘蜱传播非洲猪瘟病毒的研究进展及防控建议

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中国预防兽医学报 2020年第4期42卷 418-421页

作者：吴绍强邓俊花吕继洲林祥梅中国检验检疫科学研究院北京100176

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fe-ver virus,ASFV)引起的严重危害养猪业的烈性传染病,历史上在非洲、欧洲的多个国家暴发流行。自2007年传入高加索地区以来,疫情在中亚、东欧等地扩散,并于2018年8月在我国辽宁省沈阳地区首... 详细信息

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fe-ver virus,ASFV)引起的严重危害养猪业的烈性传染病,历史上在非洲、欧洲的多个国家暴发流行。自2007年传入高加索地区以来,疫情在中亚、东欧等地扩散,并于2018年8月在我国辽宁省沈阳地区首次报道,在不到一年的时间里传播到全国31个省.

关键词：非洲猪瘟病毒经卵传递防控建议中肠上皮细胞经卵传播拉合尔钝缘蜱乳突钝缘蜱生物媒介媒介蜱

施马伦贝格病毒N蛋白双单抗夹心ELISA检测方法的建立

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质量安全与检验检测 2023年第3期33卷 12-15,31页

作者：魏方陈冬杰邓俊花王晶晶吴绍强中国检验检疫科学研究院北京100176

为建立施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)的双抗体夹心ELISA方法,本研究利用原核表达系统纯化SBV N蛋白,并免疫小鼠制备抗SBV N蛋白单克隆抗体(mAb)。以制备的mAb 4D6作为捕获抗体,HRP标记的mAb 5D3经作为检测抗体,经条件优化,... 详细信息

为建立施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)的双抗体夹心ELISA方法,本研究利用原核表达系统纯化SBV N蛋白,并免疫小鼠制备抗SBV N蛋白单克隆抗体(mAb)。以制备的mAb 4D6作为捕获抗体,HRP标记的mAb 5D3经作为检测抗体,经条件优化,建立了基于SBV N蛋白的双单抗夹心ELISA检测方法。结果显示,捕获抗体和检测抗体的稀释度分别为1∶160000和1∶80000,重组SBV N蛋白浓度在3.9~125 ng/mL范围与OD450nm值呈现良好的线性关系,标准曲线为y=0.0224x+0.3896,R^(2)=0.9715。此方法检测下限为3.9 ng/mL,显示较高的敏感性。该方法检测AKAV、BTV和BVDV均为阴性,具有良好的特异性。因此,本研究建立的双单抗夹心ELISA方法为SBV快速诊断和N蛋白功能研究提供技术支撑。

关键词：施马伦贝格病毒核衣壳蛋白双单抗夹心ELISA