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MACC1基因沉默通过ERK通路对卵巢上皮性癌细胞顺铂敏感性的影响

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MACC1基因沉默通过ERK通路对卵巢上皮性癌细胞顺铂敏感性的影响

作者：邓佑兴郑州大学

学位级别：硕士

背景作为一种严重威胁女性健康和生命的恶性肿瘤，卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤第一位。卵巢癌具有起病隐匿、发现晚、转移早、进展快及预后差的特点。目前卵巢癌的发病机理仍不十分清楚。由于卵巢居于盆腔底部，所以卵巢癌缺乏早期特异... 详细信息

背景作为一种严重威胁女性健康和生命的恶性肿瘤，卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤第一位。卵巢癌具有起病隐匿、发现晚、转移早、进展快及预后差的特点。目前卵巢癌的发病机理仍不十分清楚。由于卵巢居于盆腔底部，所以卵巢癌缺乏早期特异性症状，患者因腹胀等原因就诊时约70%已是晚期。晚期卵巢上皮性癌行肿瘤细胞减灭术和以铂类为基础的化学治疗。肿瘤细胞减灭术旨在最大限度和范围的切除肿瘤组织，但术后可能残留的病灶仍然无法避免。因此，化疗对晚期卵巢癌患者来说必不可少。但部分患者对化疗药物尤其一线药物顺铂耐药却造成治疗失败。化疗耐药又可分为内在性耐药和获得性耐药两大类：约15％-25％的卵巢癌患者对以铂类为基础的联合化疗方案内在性耐药，即为原发耐药;而至少80％的接受化疗的患者在治疗过程中逐渐对顺铂产生耐药性，称为获得性耐药，即为继发性耐药。化疗耐药严重制约着卵巢癌患者的生活质量和生存期。因此，近年来，科学研究者在不断寻找改善患者化疗敏感性的方法。2009年，Stein等在结肠癌中发现了一个新的基因，因其与结肠癌的转移密切相关，因而这个基因被称为结肠癌转移相关基因-1(Metastasis-associated in colon cancer-1，MACCl)。MACC1是肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）／C-MET信号转导途径的一个重要调节因子，通过提高c-met的表达，在结肠癌的侵袭、转移过程中起着重要作用。后来，国内外科学研究者在多种人类恶性肿瘤中发现了MACC1的高表达，比如肝细胞癌、胆囊癌、胃癌、食管癌、乳腺癌等。本课题组前期研究发现，卵巢上皮性癌中检测到异于卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织中的MACC1mRNA及蛋白的高表达，并合成了MACC1基因特异性shRNA，成功转染人卵巢癌细胞OVCAR-3，通过一系列功能实验发现转染后OVCAR-3细胞的增殖、迁移、侵袭能力减弱，而凋亡增加;通过RT-PCR和Western Blot发现转染细胞的C-met、p-ERK1/2、cyclinD1、survivin、MMP9、MMP2及VEGFA等表达显著减少，提示MACC1可能通过HGF/C-met信号通路及下游的MAPK通路来调节肿瘤相关的一系列基因表达来参与卵巢癌的恶性进展过程。但MACC1是否参与卵巢癌对顺铂敏感性的调节，目前国内外尚无文献显示。本研究通过RNA干扰（RNA interferring，RNAi）技术分别抑制人上皮性卵巢癌细胞亲本株SKOV3和相应的顺铂耐药株SKOV3/DDP细胞中MACC1表达，应用RT-PCR检测细胞中MACC1基因的mRNA的表达情况，同时采用western blot方法检测MACC1、ERK1/2、p-ERK1/2、caspase-3及cleaved caspase-3蛋白的表达，MTT法检测细胞增殖及顺铂敏感性变化，Transwell法研究细胞体外侵袭能力的变化，探讨MACC1基因抑制对上皮性卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响，以及MACC1基因抑制后ERK通路蛋白的变化，试图进一步了解MACC1是否通过ERK通路对卵巢癌顺铂敏感性产生影响，并为寻求临床上有效逆转卵巢癌耐药提供新的思路。目的通过RNA干扰技术分别抑制SKOV3和SKOV3/DDP细胞中MACC1表达，分析MACC1基因抑制后卵巢癌细胞增殖、凋亡及顺铂敏感性的变化，分析MACC1影响卵巢癌上述生物学行为的分子机制，为临床上逆转卵巢癌耐药提供一个新的思路。方法1.前期设计的针对MACC1mRNA的小发卡状RNA转染卵巢癌细胞SKOV3，RT-PCR及Western blot分别检测MACC1mRNA和蛋白表达，并检测ERK1/2及p-ERK1/2蛋白含量的变化以及ERK通路抑制剂PD98059对上述蛋白水平的影响。MTT法评价细胞对顺铂化疗敏感性的变化。2.前期设计的针对MACC1mRNA的小发卡状RNA转染卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP，RT-PCR及Western blot检测MACC1mRNA和蛋白表达，并检测ERK1/2及p-ERK1/2、caspase-3及cleaved caspase-3蛋白含量的变化以及ERK通路抑制剂PD98059对上述蛋白水平的影响。MTT法、FCM法和Transwell实验分别评价细胞增殖能力和顺铂化疗敏感性、凋亡的变化及细胞体外迁移能力的变化。3.统计学处理：利用SPSS17.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析比较各组细胞MACC1mRNA及蛋白、下游蛋白、细胞IC50、细胞凋亡率差异，采用LSD-t法行两两比较。检验水准=0.05。结果1.在SKOV3中，转染MACC1shRNA的细

关键词：结肠癌转移相关基因1 卵巢癌顺铂细胞外信号激酶

SiRNA干扰结肠癌转移相关基因1表达对卵巢癌顺铂化疗耐药性的影响

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肿瘤 2014年第1期34卷 7-12页

作者：李霞史惠蓉邓佑兴张瑞涛郑州大学第一附属医院妇产科河南郑州450052

目的:利用RNA干扰技术抑制结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer 1,MACC1)在顺铂(cisplatin,DDP)耐药的卵巢癌细胞株SKOV-3/DDP中的表达,并探讨其对DDP化疗耐药性的影响。方法:RNA干扰分为3组,空白对照组为未经... 详细信息

目的:利用RNA干扰技术抑制结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer 1,MACC1)在顺铂(cisplatin,DDP)耐药的卵巢癌细胞株SKOV-3/DDP中的表达,并探讨其对DDP化疗耐药性的影响。方法:RNA干扰分为3组,空白对照组为未经处理的SKOV-3/DDP细胞,阴性对照组为空质粒转染的SKOV-3/DDP-shVector细胞,实验组为MACC1-shRNA重组质粒转染的SKOV-3/DDP-shMACC1细胞。反转录PCR法和蛋白质印迹法检测稳定转染后SKOV-3/DDP细胞中MACC1 mRNA和蛋白的表达情况,MTT法检测细胞对DDP的耐药性变化,FCM法检测细胞凋亡变化。结果:相比于未转染组SKOV-3/DDP细胞,MACC1-shRNA转染组SKOV-3/DDP-shMACC1细胞中MACC1的mRNA及蛋白水平均明显下调[下调百分率分别为(83.39±1.26)%和(82.25±2.94)%,P<0.05]。DDP对SKOV-3/DDP-shMACC1细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC_(50))值与未转染组和空质粒转染组细胞的IC_(50)值比较,均明显降低[(26.09±0.91)μmol/L vs(47.50±0.40)μmol/L和(47.08±0.45)μmol/L,P<0.05]。SKOV-3/DDP-shMACC1细胞凋亡率明显提高[(13.77±0.60)%vs(3.63±0.30)%和(4.23±0.30)%,P<0.05]。结论:RNA干扰抑制MACC1基因表达能增强卵巢癌耐药细胞SKOV-3/DDP对DDP的敏感性。

关键词：卵巢肿瘤 RNA干扰抗药性,肿瘤顺铂结肠癌转移相关基因1

腹腔镜下输卵管妊娠开窗取胚术后缝合对卵巢储备功能的影响

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山东医药 2017年第21期57卷 82-84页

作者：邓佑兴文璞邵雪王艳红张敏郑州市妇幼保健院郑州450012

目的探讨腹腔镜下输卵管妊娠开窗取胚术后创面缝合与否对卵巢储备功能的影响。方法将80例输卵管妊娠患者随机分为A、B组各40例。A组输卵管开窗取胚术后行创面缝合,B组输卵管开窗取胚术后未缝合。分别于术前及术后第3、6个月用ELISA法检... 详细信息

目的探讨腹腔镜下输卵管妊娠开窗取胚术后创面缝合与否对卵巢储备功能的影响。方法将80例输卵管妊娠患者随机分为A、B组各40例。A组输卵管开窗取胚术后行创面缝合,B组输卵管开窗取胚术后未缝合。分别于术前及术后第3、6个月用ELISA法检测两组血清雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)和抗苗勒管激素(AMH);采用阴道超声检查测量卵巢体积、窦卵泡数量。结果术后3、6个月,A组血清E2、LH、FSH、AMH与B组比较,P均0.05;A组窦卵泡数量与B组比较,P均<0.05。结论腹腔镜下输卵管妊娠开窗取胚术后行输卵管缝合可在一定程度上减轻对卵巢储备功能的损害,保护患者生育功能。

关键词：输卵管妊娠腹腔镜手术输卵管开窗取胚术输卵管缝合卵巢储备功能

MACC1基因表达下调对卵巢上皮性癌细胞SKOV3顺铂敏感性的影响

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中国妇幼保健 2014年第4期29卷 596-599页

作者：邓佑兴史惠蓉李霞张瑞涛郑州大学第一附属医院妇产科河南郑州450052

目的:探讨通过RNA干扰技术沉默MACC1基因的表达对卵巢上皮性癌细胞SKOV3顺铂敏感性的影响及其可能机制。方法:前期构建的针对MACC1 mRNA的小发卡状RNA重组表达载体转染卵巢癌SKOV3细胞,获得MACC1基因表达下调的shRNA-MACC1-SKOV3细胞。R... 详细信息

目的:探讨通过RNA干扰技术沉默MACC1基因的表达对卵巢上皮性癌细胞SKOV3顺铂敏感性的影响及其可能机制。方法:前期构建的针对MACC1 mRNA的小发卡状RNA重组表达载体转染卵巢癌SKOV3细胞,获得MACC1基因表达下调的shRNA-MACC1-SKOV3细胞。RT-PCR及Western blot检测MACC1 mRNA和蛋白表达,并检测ERK1/2和p-ERK1/2蛋白含量的变化以及ERK1/2通路抑制剂PD98059对上述蛋白水平的影响。四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测shRNA-MACC1-SKOV3细胞顺铂敏感性变化。同时设置空白组(SKOV3细胞)和转染空质粒组(SKOV3/DDP-EGFP细胞)为对照组。结果:(1)shRNA-MACC1-SKOV3细胞的MACC1 mRNA和蛋白明显降低。(2)shRNA-MACC1-SKOV3细胞p-ERK1/2表达明显降低,在此基础上加入PD98059后p-ERK1/2表达改变更为明显。(3)shRNA-MACC1-SKOV3细胞的顺铂半数抑制浓度(IC50)为(20.420±1.437)μmol/L,明显低于空白组和转染空质粒组[分别为(28.168±0.899)和(27.071±1.229)μmol/L。结论:SKOV3细胞中MACC1基因表达下调导致细胞对顺铂的敏感性增加,可能与下游的ERK1/2通路受到抑制有关。

关键词：结肠癌转移相关基因1(MACC1) 卵巢癌 ERK 顺铂

沉默MACC1基因对人卵巢癌耐药细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

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山东医药 2017年第26期57卷 21-24页

作者：邓佑兴史惠蓉李霞张瑞涛郑州市妇幼保健院郑州450052 郑州大学第一附属医院

目的观察应用基因沉默技术抑制人卵巢癌耐药细胞结肠癌转移相关基因1(MACC1)表达后,细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化及其分子机制。方法将人卵巢癌耐药细胞株SKOV-3/DDP分成空质粒组和转染组,分别转染空质粒p-super-EGFP、重组质粒p-sup... 详细信息

目的观察应用基因沉默技术抑制人卵巢癌耐药细胞结肠癌转移相关基因1(MACC1)表达后,细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化及其分子机制。方法将人卵巢癌耐药细胞株SKOV-3/DDP分成空质粒组和转染组,分别转染空质粒p-super-EGFP、重组质粒p-super-EGFP-MACC1 shRNA,另取未经处理的SKOV-3/DDP细胞作为空白对照组。采用RT-PCR方法检测各组MACC1 mRNA表达,Western blotting法检测MACC1蛋白表达,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,体外黏附试验检测细胞体外黏附力,Transwell小室检测细胞侵袭能力,Western blotting法测定C-met、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达。结果与空白对照组和空质粒组比较,转染组MACC1 mRNA和蛋白表达减少,细胞48、72 h增殖能力减弱,细胞凋亡率增加,体外黏附和侵袭能力减弱,C-met、pERK1/2蛋白表达增加(P均0.05)。结论MACC1基因表达抑制后,SKOV-3/DDP的增殖、黏附和侵袭能力减弱,细胞凋亡增加,这可能与HGF/C-met和ERK通路受抑制有关。

关键词：卵巢癌结肠癌转移相关基因1 细胞增殖细胞凋亡细胞侵袭

沉默MACC1的表达对卵巢癌细胞系SKOV-3顺铂化疗敏感性的影响

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郑州大学学报（医学版） 2016年第1期51卷 92-95页

作者：李霞史惠蓉邓佑兴张瑞涛郑州大学第一附属医院妇产科河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室郑州450052

目的:探讨沉默结肠癌转移相关基因1(MACC1)对卵巢癌上皮性癌细胞SKOV-3顺铂化疗敏感性的影响。方法:SKOV-3细胞分为shRNA转染组(重组质粒psuper-EGFP-s3转染)、空质粒转染组(psuper-EGFP-neo转染)和对照组(未作转染),采用RT-PCR法和West... 详细信息

目的:探讨沉默结肠癌转移相关基因1(MACC1)对卵巢癌上皮性癌细胞SKOV-3顺铂化疗敏感性的影响。方法:SKOV-3细胞分为shRNA转染组(重组质粒psuper-EGFP-s3转染)、空质粒转染组(psuper-EGFP-neo转染)和对照组(未作转染),采用RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞MACC1 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞对顺铂的耐药性。结果:3组SKOV-3细胞MACC1 mRNA和蛋白表达比较,差异有统计学意义(P<0.05),shRNA转染组较未转染组和空质粒组下降。shRNA转染组对顺铂的IC50较对照组和空质粒转染组下降(P<0.05)。结论:沉默MACC1的表达能增加卵巢癌SKOV-3细胞对顺铂的敏感性。

关键词：结肠癌转移相关因子1 RNA干扰顺铂敏感性卵巢癌 SKOV-3细胞

MACC1基因干扰对卵巢上皮性癌细胞增殖和顺铂耐药的影响

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中国癌症杂志 2013年第12期23卷 967-973页

作者：邓佑兴史惠蓉李霞张瑞涛郑州大学第一附属医院妇产科河南郑州450052

背景与目的:有研究发现,结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer-1,MACC1)在多种肿瘤中高表达,其通过调节细胞外信号激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2信号通路影响肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程。而对于MACC1在卵巢癌中的作用研究甚少。本研究应用RNA干扰(RNAi)技术逆转卵巢上皮性癌耐药细胞中MACC1基因的表达,并探讨MACC1基因表达与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系。方法:前期设计的针对MACC1 mRNA的小发卡状RNA(shRNA)转染卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP细胞,RT-PCR及Western blot检测MACC1 mRNA和蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑蓝法检测转染前后SKOV3/DDP细胞的增殖及对顺铂的半数抑制浓度(IC50),流式细胞仪测定顺铂处理前后各组细胞凋亡率。Western blot检测ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的变化。实验分3组:空白组为未经处理的SKOV3/DDP细胞,阴性对照组转染空质粒p-super-EGFP-1,实验组转染重组质粒p-super-EGFP-MACC1 shRNA。结果:与其他两组细胞相比,实验组细胞MACC1 mRNA及蛋白降低,对顺铂的IC50较低(26.094 vs 47.501/47.089μmol/L,P<0.05),p-ERK1/2蛋白表达下降(0.3979 vs 0.6712/0.6681,P<0.05),顺铂处理前、后凋亡率增加(1.32%vs 0.66%/0.48%,P<0.05;36.70%vs 18.53%/16.60%,P=0.000)。结论:MACC1基因表达下调能在一定程度上恢复SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性,可能与ERK1/2通路有关。

关键词：结肠癌转移相关基因1 卵巢癌顺铂细胞外信号激酶

门冬胰岛素和生物合成人胰岛素在妊娠期糖尿病治疗中的临床效果探究

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现代诊断与治疗 2017年第23期28卷 4372-4373页

作者：邓佑兴邵雪冯秀梅郑州市妇幼保健院妇产科河南郑州450003

对比门冬胰岛素和生物合成人胰岛素在妊娠期糖尿病(GDM)治疗中的临床效果。选择2016年1月~2017年1月我院收治的GDM患者110例,以随机数字表将其分为对照组与观察组,各55例。观察组应用门冬胰岛素治疗,对照组应用生物合成人胰岛素治疗。... 详细信息

对比门冬胰岛素和生物合成人胰岛素在妊娠期糖尿病(GDM)治疗中的临床效果。选择2016年1月~2017年1月我院收治的GDM患者110例,以随机数字表将其分为对照组与观察组,各55例。观察组应用门冬胰岛素治疗,对照组应用生物合成人胰岛素治疗。观察组治疗后空腹血糖、餐后2h血糖及糖化血红蛋白水平均低于对照组(P0.05)。相较于生物合成人胰岛素,门冬胰岛素治疗GDM的治疗效果更为确切,且安全性佳,适于临床推广。

关键词：门冬胰岛素生物合成人胰岛素妊娠期糖尿病治疗

诺和锐特充治疗妊娠期糖尿病的临床效果及安全性分析

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现代诊断与治疗 2017年第22期28卷 4223-4224页

作者：邵雪邓佑兴冯秀梅郑州市妇幼保健院妇产科河南郑州450003

探讨诺和锐特充治疗妊娠期糖尿病(GDM)的临床效果及安全性。选择2016年1月~2017年1月我院收治的GDM患者116例,随机数字表原则将其分为对照组与观察组,各58例。对照组注射诺和灵R治疗,观察组注射诺和锐特充治疗。观察组治疗后空腹血糖与... 详细信息

探讨诺和锐特充治疗妊娠期糖尿病(GDM)的临床效果及安全性。选择2016年1月~2017年1月我院收治的GDM患者116例,随机数字表原则将其分为对照组与观察组,各58例。对照组注射诺和灵R治疗,观察组注射诺和锐特充治疗。观察组治疗后空腹血糖与餐后2h血糖水平均低于对照组(P0.05)。诺和锐特充治疗GDM可以有效降低血糖水平,保证妊娠结局,安全性较佳,适于临床推广。

关键词：诺和锐特充妊娠期糖尿病临床效果安全性