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苹果锈果类病毒属属级寡核苷酸芯片筛查方法的建立

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生物技术通报 2013年第2期29卷 151-156页

作者：张永江辛言言朱水芳李世访中国检验检疫科学研究院北京100029 中国农业科学院植物保护研究所北京100193

苹果锈果类病毒属是重要的植物类病毒属,目前尚无有效的筛查方法。通过对该属类病毒的核苷酸序列进行分析筛选,设计了35条用于该属类病毒筛查的属级特异性探针并制备了寡核苷酸芯片。应用苹果锈果类病毒及柑橘矮化类病毒标准样品对该芯... 详细信息

苹果锈果类病毒属是重要的植物类病毒属,目前尚无有效的筛查方法。通过对该属类病毒的核苷酸序列进行分析筛选,设计了35条用于该属类病毒筛查的属级特异性探针并制备了寡核苷酸芯片。应用苹果锈果类病毒及柑橘矮化类病毒标准样品对该芯片进行验证,结果表明所建立的属级芯片可以获得有效的杂交信号,其灵敏度与RT-PCR电泳法相当。该芯片可用于苹果锈果类病毒属类病毒的筛查,为该属类病毒的检疫与防控提供技术支撑。

关键词：苹果锈果类病毒属属级探针寡核苷酸芯片

苹果锈果类病毒RT-LAMP检测方法的建立

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植物检疫 2014年第1期28卷 33-37页

作者：辛言言李曼张永江马荣群朱水芳李志红中国检验检疫科学研究院北京100029 中国农业大学青岛市农业科学研究院

本研究根据苹果锈果类病毒(ASSVd)基因组全序列设计LAMP特异性引物,并通过优化引物最终建立了ASSVd的RT-LAMP检测方法。该方法可有效区分同属的澳洲葡萄类病毒(AGVd)、葡萄黄点类病毒(GYSVd)、柑桔类病毒III(CiVd III),具有灵敏度高、... 详细信息

本研究根据苹果锈果类病毒(ASSVd)基因组全序列设计LAMP特异性引物,并通过优化引物最终建立了ASSVd的RT-LAMP检测方法。该方法可有效区分同属的澳洲葡萄类病毒(AGVd)、葡萄黄点类病毒(GYSVd)、柑桔类病毒III(CiVd III),具有灵敏度高、特异性强及检测时间短的特点,可用于现场ASSVd的快速检测。

关键词：苹果锈果类病毒环介导等温扩增检测

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棉花皱叶病毒分子检测方法

植物检疫 2013年第1期27卷 53-57页

作者：雷荣辛言言乔文婕周雪平鲁洁马洁张永江中国检验检疫科学研究院北京100029 浙江大学

棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV)是典型的双生病毒,含A和B两个组分。根据B组分的保守序列设计的一对普通PCR引物,得到约为636 bp的片段,实验结果显示能特异性地扩增CLCrV B组分,棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl virus,CLC... 详细信息

棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV)是典型的双生病毒,含A和B两个组分。根据B组分的保守序列设计的一对普通PCR引物,得到约为636 bp的片段,实验结果显示能特异性地扩增CLCrV B组分,棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl virus,CLCuV)、非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaec vi-rus,ACMV)、花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)及番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)不干扰普通RCR方法对CLCrV的检测。设计的实时荧光PCR引物和探针也能特异性地检测棉花皱叶病毒,而CLCuV、ACMV和TYLCV不影响实时荧光PCR对CLCrV的检测。

关键词：棉花皱叶病毒 PCR 实时荧光PCR 检测

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葡萄A病毒RT-LAMP检测方法的建立

中国农业科学 2016年第1期49卷 103-109页

作者：张永江辛言言李桂芬乾义柯中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所伊犁出入境检验检疫局

【目的】葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)是葡萄皱木复合病的重要病原之一,以带毒种苗的嫁接为田间主要传播途径。使用无毒葡萄苗木进行生产是控制该病毒病害的根本措施,而简便灵敏的检测技术是筛选无毒种苗的有效保证。为此,开展针对... 详细信息

【目的】葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)是葡萄皱木复合病的重要病原之一,以带毒种苗的嫁接为田间主要传播途径。使用无毒葡萄苗木进行生产是控制该病毒病害的根本措施,而简便灵敏的检测技术是筛选无毒种苗的有效保证。为此,开展针对GVA的反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)研究,旨在建立其RT-LAMP特异性检测方法。【方法】通过比对分析GVA的CP(coat protein)基因序列并经引物设计软件Primer Explore 4.0设计,获得6条检测引物GVA-FIP(5′-CTTACAGCCACGCTCAGAGTCC-CGTGGGAAGTTGGTTGTGT-3′)、GVA-BIP(5′-GCCCGTCAAAGGGGCTACAC-TCATA GGCGTTCTGTGCGA-3′)、GVA-F3(5′-AGAAGATGGGGATAGACCCG-3′)、GVA-B3(5′-CCGCCATTAACACGAGGAA-3′)、GVA-LF(5′-AT CCTTCCCACCAGCTCGG-3′)和GVA-LB(5′-TCAGGCAGATGTGTGAACCT-3′)。将RT-LAMP的反应温度分别设为59、61、63和65℃,根据1 h扩增曲线出现的先后次序确定最佳反应温度。以同样侵染葡萄的沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPa V)、葡萄卷叶病毒(Grapevine leafrollassociated virus,GLRa V)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFKV)的阳性材料及阴性对照(健康葡萄叶片,用NC表示)的总RNA为模板,对RT-LAMP方法的特异性进行测定。将GVA的总RNA进行10倍梯度稀释,得到10~1、10~2、10~3、10~4、10~5、10~6倍的不同稀释液后用作模板分别进行RT-LAMP和普通RT-PCR检测,比较两者的灵敏度。RT-LAMP产物可进行实时扩增曲线检测,阳性样品在浊度仪上出现扩增曲线,阴性样品无扩增曲线;还可进行染料颜色反应检测,在反应产物中加入SYBR Green I染料,阳性样品产生肉眼可见的绿色,阴性反应为橙色。【结果】建立了GVA的RT-LAMP快速特异性检测方法,最佳反应温度为65℃。该方法约27 min即可检测到扩增曲线,而普通RT-PCR获得检测结果约需1.5 h。特异性试验表明只有GVA的总RNA能够出现扩增曲线,反应液颜色变为绿色,显示为阳性,而其他3种参试病毒和健康对照没有出现扩增曲线,反应液的颜色为橙色,显示为阴性;RT-LAMP检测结果可通过肉眼观察直接判断,比普通RT-PCR结果判断容易。灵敏度试验显示RT-LAMP可检测到10~1、10~2、10~3、10~4和10~5倍的GVA总RNA稀释液模板,而普通RT-PCR只能检测到10~1、10~2、10~3和10~4倍的GVA总RNA稀释液模板,表明前者比后者的灵敏度高10倍。【结论】研究建立的RT-LAMP方法能够快速特异地检测GVA,可为筛选无GVA葡萄苗木提供技术支持;适用于检疫、科研及生产机构在进境检疫、苗木繁育和大田监测工作中对GVA的检测鉴定。

关键词：葡萄A病毒反转录环介导等温扩增技术检测

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实时荧光RT-PCR方法检测马铃薯V病毒

江苏农业科学 2013年第6期41卷 36-38页

作者：张永江辛言言李桂芬马洁魏梅生朱水芳沈建国中国检验检疫科学研究院北京100029 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心福建福州350001

为了给马铃薯V病毒提供快速灵敏的检测技术以防止其传播扩散,根据其外壳蛋白基因核苷酸保守序列设计引物和TaqMan探针,通过特异性及灵敏度试验建立该病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度高,至少可检测到36 pg/μL的总RNA;... 详细信息

为了给马铃薯V病毒提供快速灵敏的检测技术以防止其传播扩散,根据其外壳蛋白基因核苷酸保守序列设计引物和TaqMan探针,通过特异性及灵敏度试验建立该病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度高,至少可检测到36 pg/μL的总RNA;对马铃薯V病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、李痘病毒及马铃薯X病毒具有良好的特异性。该方法快速、灵敏、无需任何PCR后处理且交叉污染风险小,可用于马铃薯V病毒的快速检测。

关键词：马铃薯V病毒实时荧光RT—PCR方法检测

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宁夏固原地区马铃薯M病毒的检测鉴定

河南农业科学 2013年第8期42卷 79-81,85页

作者：张永江刘忠梅燕照玲刘洪义马洁陈林辛言言马云霞中国检验检疫科学研究院北京100029 黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心黑龙江哈尔滨150001 河南省农业科学院农业经济与信息研究中心河南郑州450002 宁夏出入境检验检疫局宁夏银川750001

为了解宁夏固原地区马铃薯M病毒(potato virus M,PVM)发生情况,采集了18份表现叶片变形、茎坏死及植株矮化症状的样品,应用血清学(DAS-ELISA)和分子生物学(RT-PCR)方法进行检测。DAS-ELISA检测结果显示,有2份样品(5号和10号)为PVM阳性。... 详细信息

为了解宁夏固原地区马铃薯M病毒(potato virus M,PVM)发生情况,采集了18份表现叶片变形、茎坏死及植株矮化症状的样品,应用血清学(DAS-ELISA)和分子生物学(RT-PCR)方法进行检测。DAS-ELISA检测结果显示,有2份样品(5号和10号)为PVM阳性。对2份阳性样品进行RT-PCR检测,均获得416bp的目的产物,其序列与国内外已报道的其他PVM分离物的核苷酸序列同源性最高分别达99%和98%,说明被检测样品确实感染了PVM。这是PVM在宁夏固原发生的首次报道,为今后该地区马铃薯病毒病害的防控提供了依据。

关键词：宁夏固原马铃薯M病毒检测鉴定

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棉花皱叶病毒LAMP检测方法的建立

西北农业学报 2014年第2期23卷 85-91页

作者：李曼辛言言朱水芳李志红郭立新张永江中国农业大学北京100193 中国检验检疫科学研究院北京100123 北仑出入境检验检疫局宁波315800

棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV)是危害棉花的重要病毒之一,属中国进境检疫性植物病毒,本研究根据其DNA-B基因序列设计LAMP特异性引物,通过试验建立CLCrV的LAMP检测方法。该方法检测快速,15min即可检测到扩增曲线;特异性... 详细信息

棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV)是危害棉花的重要病毒之一,属中国进境检疫性植物病毒,本研究根据其DNA-B基因序列设计LAMP特异性引物,通过试验建立CLCrV的LAMP检测方法。该方法检测快速,15min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同属的CLCrV、棉花曲叶病毒(CLCuV)、非洲木薯花叶病毒(ACMV)及番茄黄化曲叶病毒(TYLCV);灵敏度高,可检测到约43fg/μL的总DNA,比普通PCR灵敏度高1 000倍;并可通过肉眼观察浊度或颜色反应进行结果判断。该方法适用于现场CLCrV的快速检测。

关键词：棉花皱叶病毒环介导等温扩增检测

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应用纳米磁珠荧光PCR检测棉花曲叶病毒

棉花学报 2013年第1期25卷 90-94页

作者：张永江李明福辛言言李桂芬马洁邓丛良中国检验检疫科学研究院北京100029 北京出入境检验检疫局北京100026

为了提供快速灵敏检测棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl virus,CLCuV)的技术以防止其传播扩散,本研究根据CLCuV外壳蛋白基因(Coat protein,CP)保守序列设计了引物和TaqMan探针,并结合纳米磁珠(Magneticnanoparticles,MNPs)建立了该病毒的... 详细信息

为了提供快速灵敏检测棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl virus,CLCuV)的技术以防止其传播扩散,本研究根据CLCuV外壳蛋白基因(Coat protein,CP)保守序列设计了引物和TaqMan探针,并结合纳米磁珠(Magneticnanoparticles,MNPs)建立了该病毒的MNP实时荧光PCR(Real-time PCR)检测方法。该方法检测阈值约为525 fg.μL-1DNA。通过对CLCuV、非洲木薯花叶病毒、烟草线条病毒、黄瓜花叶病毒及番茄斑萎病毒的检测表明,该方法具有良好的特异性;同时该方法无需任何PCR后处理,交叉污染风险小。本方法可用于CLCuV的快速检测。

关键词：棉花曲叶病毒实时荧光PCR 检测

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番茄黑环病毒液相芯片快速检测方法的建立

北方园艺 2013年第1期 127-130页

作者：张永江辛言言李桂芬刘忠梅刘洪义中国检验检疫科学研究院北京100029 黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心黑龙江哈尔滨150001

为建立番茄黑环病毒(Tomato black ring virus,TBRV)的液相芯片检测技术,对GenBank中的TBRV核苷酸序列进行分析,设计其特异性探针并用生物素标记。探针偶联荧光编码微球后与TBRV的RT-PCR产物进行杂交,用液相芯片检测仪检测荧光信号。结... 详细信息

为建立番茄黑环病毒(Tomato black ring virus,TBRV)的液相芯片检测技术,对GenBank中的TBRV核苷酸序列进行分析,设计其特异性探针并用生物素标记。探针偶联荧光编码微球后与TBRV的RT-PCR产物进行杂交,用液相芯片检测仪检测荧光信号。结果表明:建立的方法具有良好的特异性,能够有效区分侵染马铃薯的TBRV、马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)、马铃薯A病毒(PVA)及番茄斑萎病毒(TSWV);检测灵敏度约为1pg/μL总RNA,与常规RT-PCR灵敏度相当。实际样品检测结果表明该方法可用于TBRV的日常检测。

关键词：番茄黑环病毒(TBRV) 液相芯片技术检测