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上海交通大学学报（医学版） 2019年第5期39卷 478-486页

作者：朱超南陈沁雯辛晨歌李慧上海交通大学基础医学院组织胚胎学与遗传发育学系

目的·在人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)中构建基于CRISPR 干扰系统的多基因同时抑制系统,作为研究家族基因功能和构建多基因疾病模型的工具。方法·通过Golden Gate 克隆法在hESCs 中建立受强力霉素(doxycycline,Dox... 详细信息

目的·在人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)中构建基于CRISPR 干扰系统的多基因同时抑制系统,作为研究家族基因功能和构建多基因疾病模型的工具。方法·通过Golden Gate 克隆法在hESCs 中建立受强力霉素(doxycycline,Dox)调控的多基因CRISPR 干扰系统。该系统主要由2 个质粒组成:1 个质粒在Dox 调控下融合表达核酸酶失活的CRISPR 相关蛋白9(nucleasedeactivatedCRISPR-associated protein 9,dCas9)和Krüppel 相关盒(Krüppel-associated box,KRAB)抑制结构域(dCas9-KRAB),另1 个质粒可同时表达8 个独立的导向RNA(guide RNA,gRNA)来分别引导dCas9-KRAB 蛋白到基因组特定位点抑制转录起始或延伸。以基因组DNA 为模板进行PCR,确定2 个质粒是否整合至细胞基因组,并通过Western blotting 确定细胞在Dox 诱导下是否可表达dCas9-KRAB 蛋白。结果·使用这种可调控的多基因CRISPR 干扰系统,可在Dox 诱导下在hESCs 中同时成功抑制多个基因的表达;并且这些基因的表达被抑制导致hESCs 形态改变,碱性磷酸酶活性下降,hESCs 表面标志物阶段特异性胚胎表面抗原4(stagespecificembryonic antigen 4,SSEA4)的表达下降,hESCs 发生分化。结论·该CRISPR 干扰系统可以在hESCs 中高效地同时抑制多个基因的表达,是十分有效的多基因研究工具。

关键词： CRISPR干扰系统可诱导的多基因同时抑制 GoldenGate克隆法人胚胎干细胞

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