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RNA适体研究及其在医药上的应用

中国生物化学与分子生物学报 2013年第7期29卷 597-603页

作者：朱颖于文功路新枝教育部海洋药物重点实验室山东省糖科学与糖工程重点实验室中国海洋大学医药学院山东青岛266003

核酸适体(nucleic acid aptamer)是从人工合成的随机单链核酸库中筛选出的特异性与靶物质高度亲和的核酸分子,包括DNA适体和RNA适体.体外获得核酸适体的方法称为指数富集配体系统进化技术,即SELEX(systematic evolution of ligands by e... 详细信息

核酸适体(nucleic acid aptamer)是从人工合成的随机单链核酸库中筛选出的特异性与靶物质高度亲和的核酸分子,包括DNA适体和RNA适体.体外获得核酸适体的方法称为指数富集配体系统进化技术,即SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment).在SELEX技术获得的核酸适体中,RNA适体因其结构的多样性而具有靶分子广、亲和力高、特异性强等特点.同时,相比传统抗体,RNA适体分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性.因此,RNA适体在基础研究、临床诊断、药物研制等方面展现了广阔的应用前景.本文综述了RNA适体的产生、特点、作用方式、优势与局限性,并详细介绍了其在医药研究领域的应用.

关键词：核糖核酸适体指数富集配体系统进化技术(SELEX) 药物

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环二鸟苷酸——新型的细菌第二信使

中国生物化学与分子生物学报 2009年第5期25卷 400-406页

作者：路新枝刘湛军于文功中国海洋大学医药学院分子生物学实验室青岛266003

环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是新近发现的在细菌中普遍存在的第二信使分子,参与调节多种生理功能,包括细胞分化、从运动状态到生物被膜状态的转变、致病因子产生等.基于其对细菌抗生素耐药的物理屏障—生物被膜形成的影响,... 详细信息

环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是新近发现的在细菌中普遍存在的第二信使分子,参与调节多种生理功能,包括细胞分化、从运动状态到生物被膜状态的转变、致病因子产生等.基于其对细菌抗生素耐药的物理屏障—生物被膜形成的影响,c-di-GMP的研究越来越受到人们的关注.细胞内c-di-GMP的产生受二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)合成和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)降解两条途径调控.在结构上,通常DGC含有GGDEF结构域,PDE含有EAL结构域.c-di-GMP的作用靶点包括PilZ结构域和GEMM核开关两种类型.本文综述了c-di-GMP的代谢途径、调控机理、生物学功能等方面的最新研究进展,并对c-di-GMP在今后研究中的应用和发展趋势进行展望.

关键词：环二鸟苷酸第二信使细菌生物被膜

四色荧光标记DNA自动测序中一例典型错读码的校正

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海洋科学 2002年第3期26卷 10-13页

作者：马洪明路新枝王勇青岛海洋大学食品工程系 266003 中国科学院海洋研究所青岛266071

DNA测序是现代分子生物学研究中的重要技术。随着人类基因组计划的实施，DNA测序技术虽然在原理上没有新突破，仍然依赖于Sanger的酶法，但在不断提高自动化程度、降低成本方面取得了很大的进展，测序效率目前已有很大提高。大规模测序... 详细信息

DNA测序是现代分子生物学研究中的重要技术。随着人类基因组计划的实施，DNA测序技术虽然在原理上没有新突破，仍然依赖于Sanger的酶法，但在不断提高自动化程度、降低成本方面取得了很大的进展，测序效率目前已有很大提高。大规模测序一个碱基的成本从1986年的0.5美元降到目前的约7美分。

关键词： DNA 自动测序四色荧光标记错读码校正

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甘糖酯抗氧化作用的分子机制

药学学报 2004年第1期39卷 13-16页

作者：陈晓路新枝高焱史晓翀于文功中国海洋大学海洋药物与食品研究所山东青岛266003

目的　探讨甘糖酯 (PGMS)清除自由基抗氧化作用的分子机制。方法　给大鼠ig高脂乳剂建立高脂血症模型 ,分成对照组、甘糖酯治疗组、甘糖酯 +DDC组 ,治疗 3周。检测血清、肝脏、脾脏和主动脉中丙二醛 (MDA)的含量 ,超氧化物歧化酶 (SOD)... 详细信息

目的　探讨甘糖酯 (PGMS)清除自由基抗氧化作用的分子机制。方法　给大鼠ig高脂乳剂建立高脂血症模型 ,分成对照组、甘糖酯治疗组、甘糖酯 +DDC组 ,治疗 3周。检测血清、肝脏、脾脏和主动脉中丙二醛 (MDA)的含量 ,超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH Px)和过氧化氢酶 (CAT)的活性 ,以及Cu ,Zn SODmRNA的表达水平。结果　甘糖酯治疗组大鼠 ,丙二醛 (MDA)含量降低 ,SOD ,GSH Px和CAT的活性显著升高 ,Cu ,Zn SODmRNA的表达水平增加 ;而甘糖酯和DDC联合用药治疗组 ,DDC抑制了甘糖酯诱导的Cu ,Zn SODmRNA表达水平和SOD活性的升高 ,造成MDA含量的相应升高。结论　甘糖酯通过诱导抗氧化酶SOD ,GSH Px和CAT的活性 ,增加Cu ,Zn SODmRNA的表达水平 ,清除体内过多的氧自由基 ,达到抗氧化的目的。

关键词：甘糖酯抗氧化分子机制自由基清除高脂血症

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β-琼胶酶AgaB催化活性的定向进化

高技术通讯 2008年第2期18卷 206-210页

作者：马怡茗路新枝石超马翠萍于文功中国海洋大学医药学院青岛266003

用体外定向进化技术提高了β-琼胶酶 AgaB 热稳定突变酶 M446的催化活性。采用易错 PCR 和化学诱变法相结合的方法,构建了 M446的突变体文库;利用琼胶酶降解琼胶在平板上产生水解圈的特性,建立了阳性克隆的高通量筛选体系。最终筛选得... 详细信息

用体外定向进化技术提高了β-琼胶酶 AgaB 热稳定突变酶 M446的催化活性。采用易错 PCR 和化学诱变法相结合的方法,构建了 M446的突变体文库;利用琼胶酶降解琼胶在平板上产生水解圈的特性,建立了阳性克隆的高通量筛选体系。最终筛选得到酶活性得到提高且保持较高耐热性的突变酶 M117,其酶活提高为突变酶 M446的3倍。测序分析发现编码突变酶 M117的 DNA 序列中有4处点突变,其中2处为同义突变,另外2处引发氨基酸替换,分别为 R9K 和 I111V。对突变酶 M117与 M446的动力学常数进行了比较,发现 M117的 Km 值降低了93.4%,Kcat/Km 值提高了15倍,由此可以推断突变酶M117比活力提高的主要原因是酶与底物的亲和能力提高。

关键词：定向进化易错PCR 化学诱变酶活力 β-琼胶酶

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TRBP分子克隆及其功能初步研究

细胞与分子免疫学杂志 2012年第2期28卷 124-126,129页

作者：刘湛军朱颖于文功路新枝中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室山东青岛266003

目的:构建TRBP原核表达载体,评价表达的重组TRBP蛋白对双链RNA的结合能力。方法:利用RT-PCR扩增小鼠TRBP基因双链RNA结合区,构建其与His标签融合的表达载体,转化*** BL21(DE3)菌株,利用Ni-NTA磁珠对重组蛋白进行分离纯化;体外转录合成... 详细信息

目的:构建TRBP原核表达载体,评价表达的重组TRBP蛋白对双链RNA的结合能力。方法:利用RT-PCR扩增小鼠TRBP基因双链RNA结合区,构建其与His标签融合的表达载体,转化*** BL21(DE3)菌株,利用Ni-NTA磁珠对重组蛋白进行分离纯化;体外转录合成小鼠肝脏miR-122前体RNA Pre-miR-122,分别利用PAGE电泳和等温量热滴定仪检测TRBP与Pre-miR-122的结合能力。结果:分离纯化得到的重组TRBP蛋白为可溶蛋白,Mr为32 400,结合在NI-NTA磁珠上的TRBP能有效的结合Pre-miR-122。结论:成功建立了TRBP原核表达系统,初步研究了TRBP重组蛋白与双链RNA的结合能力。

关键词： RNA结合蛋白TRBP 原核表达分子间相互作用

一株产褐藻酸多糖的海洋假单胞细菌Pseudomonas sp. QDA的筛选和鉴定

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中国海洋大学学报（自然科学版） 2004年第1期34卷 60-64页

作者：韩文君路新枝肖琳于文功中国海洋大学海洋药物与食品研究所山东青岛266003

根据已获褐藻酸多糖生物合成基因簇中褐藻胶裂解酶基因 (alg L )的序列设计特异性引物 ,利用 PCR技术从海洋微生物中筛选到 1株能够分泌胞外多糖的细菌。采用形态学观察和 1 6Sr D-NA序列分析鉴定该菌株 ,结果为假单胞属细菌 ,命名为 *... 详细信息

根据已获褐藻酸多糖生物合成基因簇中褐藻胶裂解酶基因 (alg L )的序列设计特异性引物 ,利用 PCR技术从海洋微生物中筛选到 1株能够分泌胞外多糖的细菌。采用形态学观察和 1 6Sr D-NA序列分析鉴定该菌株 ,结果为假单胞属细菌 ,命名为 ***;系统发育树显示该菌株与 ***亲缘关系最近。菌株产生的胞外多糖可被褐藻胶裂解酶 (Alg L)降解 ,并在紫外 2 34nm处检测到特征性吸收 ,初步证明含有褐藻酸多糖。

关键词：褐藻胶裂解酶基因 PCR 海洋假单胞细菌 16S rDNA

甘糖酯对高脂血症大鼠主动脉中MCP-1表达的抑制作用

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药学学报 2003年第8期38卷 582-585页

作者：高焱于文功韩峰路新枝宫倩红管华诗中国海洋大学海洋药物与食品研究所山东青岛266003

目的　探讨甘糖酯对高脂血症大鼠主动脉中单核细胞趋化蛋白 1(MCP 1)表达的影响。方法　以甘糖酯或甘糖酯辅以超氧化物歧化酶 (SOD)抑制剂diethyldithiocarbamate(DDC)治疗高脂血症大鼠 3周 ,测定SOD活性、脂质过氧化产物丙二醛 (MDA)... 详细信息

目的　探讨甘糖酯对高脂血症大鼠主动脉中单核细胞趋化蛋白 1(MCP 1)表达的影响。方法　以甘糖酯或甘糖酯辅以超氧化物歧化酶 (SOD)抑制剂diethyldithiocarbamate(DDC)治疗高脂血症大鼠 3周 ,测定SOD活性、脂质过氧化产物丙二醛 (MDA)的浓度变化及主动脉中MCP 1mRNA的表达。结果　甘糖酯治疗后MCP 1mRNA的表达量显著降低 ,呈剂量依赖性关系 ;并升高SOD活性、降低MDA的含量 ;而在DDC作用下SOD活性被抑制 ,使MDA含量又升高 ,但是MCP 1mRNA水平不受影响 ,仍处于降低状态。结论　甘糖酯抑制高脂血症大鼠主动脉中MCP 1mRNA的表达。

关键词：甘糖酯单核细胞趋化蛋白-1 丙二醛高脂血症

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海洋紫色杆菌β-琼胶酶的分离纯化及性质

武汉大学学报（理学版） 2008年第4期54卷 497-502页

作者：时岩玲于文功路新枝中国海洋大学医药学院山东青岛266003

从青岛近海海水中分离得到一株高产琼胶酶的海洋紫色杆菌SY12.紫色杆菌SY12的发酵液上清经硫酸铵沉淀,凝胶过滤层析,离子交换层析和凝胶过滤层析等蛋白纯化步骤,得到纯化的野生琼胶酶AgaY.琼胶酶纯化了133.63倍,酶比活力为320.7 U/mg;... 详细信息

从青岛近海海水中分离得到一株高产琼胶酶的海洋紫色杆菌SY12.紫色杆菌SY12的发酵液上清经硫酸铵沉淀,凝胶过滤层析,离子交换层析和凝胶过滤层析等蛋白纯化步骤,得到纯化的野生琼胶酶AgaY.琼胶酶纯化了133.63倍,酶比活力为320.7 U/mg;纯化的琼胶酶经SDS-PAGE检测,显示为单一条带,其相对分子质量约为50×103.研究结果表明琼胶酶AgaY降解琼脂糖的β-1,4-糖苷键,其主要产物为新琼四糖和新琼二糖.对AgaY进行酶学性质研究,发现其最适反应pH为7.0,最适反应温度为40℃;Hg2+,Ag+,Zn2+,Cu2+和Pb2+等金属离子可以显著的抑制琼胶酶AgaY的活力.研究发现,AgaY的催化活性不依赖于离子的存在,AgaY对EDTA不敏感.

关键词：紫色杆菌 β-琼胶酶分离纯化新琼寡糖