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里氏木霉菌丝形态改造及纤维素酶合成调控网络的重塑

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里氏木霉菌丝形态改造及纤维素酶合成调控网络的重塑

作者：赵芹芹山东大学

学位级别：硕士

木质纤维素是自然界中有机固废物的主要种类。合理利用木质纤维素中的纤维素、半纤维素,对于缓解能源危机、环境污染,维持世界经济的可持续发展具有不可估量的价值。但是,木质纤维素的结构非常稳定,具有很强的抗降解性,导致其很难被有... 详细信息

木质纤维素是自然界中有机固废物的主要种类。合理利用木质纤维素中的纤维素、半纤维素,对于缓解能源危机、环境污染,维持世界经济的可持续发展具有不可估量的价值。但是,木质纤维素的结构非常稳定,具有很强的抗降解性,导致其很难被有效利用。自然界中的里氏木霉、草酸青霉、黑曲霉等丝状真菌可向胞外分泌有活性的木质纤维素降解酶,为解决木质纤维素的抗降解屏障问题提供了有效的方法。作为主要的纤维素酶生产菌,里氏木霉存在两个比较明显的不足。第一,里氏木霉的菌丝呈长丝状,在发酵过程中菌丝易缠绕成团,导致发酵液的粘度增加,进而影响传质、供氧效率。第二,里氏木霉纤维素酶、半纤维素酶的合成需要纤维素等物质的诱导才能高效表达,使得实际生产中补料发酵的难度增加,发酵成本较高。在本论文中,针对里氏木霉存在的两个不足,一方面,我们通过对gul1基因进行操作,实现了里氏木霉菌丝形态的理性改造,显著降低了发酵液粘度,为里氏木霉形态工程的改造提供了一个有效的靶点。另一方面,我们对纤维素酶转录因子进行了组合遗传操作,使得纤维素酶的合成突破了葡萄糖阻遏效应,为进一步提高里氏木霉纤维素酶产量、降低纤维素酶生产成本提供了新的思路。本论文的主要研究内容如下:1.失活里氏木霉gul1基因改造菌丝形态的研究在丝状真菌中,菌丝形态与其发酵液粘度及蛋白质的分泌水平密切相关。我们通过失活里氏木霉中的gul1基因（该基因推测编码一种mRNA结合蛋白）,构建了Δgul1菌株。与亲本菌株相比,Δgul1菌株表现出具有较短侧枝间隔的菌丝超分支表型。在纤维素酶发酵条件下,gul1的失活使菌丝团变小,发酵液粘度显著降低,并且纤维素酶的产量比亲本菌株提高了22%。其次,转录组分析显示出有一批编码细胞壁重塑酶和疏水蛋白的基因在Δgul1菌株中呈现差异表达。此外,我们对gul1回补及过表达菌株的表型也进行了研究。回补菌株显示出与出发株相似的表型,而过表达菌株则与失活株呈现相反的表型。上述结果表明,gul1在丝状真菌菌丝形态发生中的调控作用可能是保守的。本研究为里氏木霉形态的理性改造提供了一个有效的靶点。2.里氏木霉纤维素酶合成调控网络的重塑与高产菌株的构建里氏木霉中木质纤维素降解酶基因的表达调控一般发生在转录水平。我们对主要的纤维素酶转录因子XYR1、ACE2、CRE1以及在纤维素降解中具有重要作用的β-葡萄糖苷酶进行了组合遗传操作,重塑了纤维素酶合成调控网络,得到了两株纤维素酶高产菌h61和QXCB。在以葡萄糖为唯一碳源的培养基进行分批发酵时,h61菌株的滤纸酶活、β-葡萄糖苷酶酶活以及木聚糖酶活分别为3.7U/mL、15.6 U/mL以及143.2 U/mL,而出发株在此条件下基本不产酶。在以微晶纤维素为唯一碳源的培养基进行分批发酵时,h61菌株的滤纸酶活、β-葡萄糖苷酶酶活以及木聚糖酶活分别达到7.6 U/mL、6.3 U/mL以及393.4U/mL,与出发株相比分别提高了 1倍、4倍以及392倍。当以葡萄糖为初始碳源进行补料分批发酵时,h61的滤纸酶活在第五天为12.0 U/mL,β-葡萄糖苷酶酶活达到30.2U/mL。在以2%（w/v）微晶纤维素为初始碳源进行葡萄糖补料分批发酵时,h61的滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶酶活在第九天分别达到14.3 U/mL和44.4 U/mL。此外,组合遗传改造获得的另一株QXCB菌株也可在葡萄糖阻遏的条件下分泌纤维素酶。另外,我们还构建了参与蛋白分泌及降解的res1、alp1、ap3、vps5以及vps17基因的单敲菌株并测定了其产酶水平,为进一步提高里氏木霉纤维素酶产量提供了靶标基因。

关键词：丝状真菌里氏木霉菌丝形态纤维素酶蛋白生产

游动放线菌Actinoplanes sp. SE50/110阿卡波糖胞外代谢相关基因功能的初步研究

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基因组学与应用生物学 2022年第5期41卷 1006-1016页

作者：张欣赵芹芹白林泉上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

游动放线菌Actinoplanes sp. SE50/110(以下简称SE50/110)是重要的抗2型糖尿病药物阿卡波糖的生产菌株。在阿卡波糖的生物合成途径中,其胞内合成代谢途径的部分关键步骤已被详细解析,而与类似物形成相关的胞外代谢过程却少有研究。本研... 详细信息

游动放线菌Actinoplanes sp. SE50/110(以下简称SE50/110)是重要的抗2型糖尿病药物阿卡波糖的生产菌株。在阿卡波糖的生物合成途径中,其胞内合成代谢途径的部分关键步骤已被详细解析,而与类似物形成相关的胞外代谢过程却少有研究。本研究敲除了阿卡波糖胞外代谢相关基因,利用高效液相色谱检测阿卡波糖产量变化,通过淀粉酶-淀粉-碘(α-amylase-starch-iodine, ASI)显色法检测α-淀粉酶的受抑制程度,间接反映阿卡波糖类似物含量变化。结果显示,与出发菌株SE50/110相比,阿卡维基转移酶基因acbD的缺失导致阿卡波糖产量下降42%,淀粉酶基因acbE和acbZ缺失不影响阿卡波糖生产。在类似物积累方面,敲除acbE使细胞中阿卡波糖类似物的相对含量降低至野生型的14%,敲除acbZ使其积累量显著提升至野生型的3.75倍;在acbE缺失突变株的基础上继续敲除acbD后,类似物相对含量进一步下降至野生型的9%,为利用ASI显色法筛选高产突变株提供了背景清晰的衍生菌株。本研究通过体内基因敲除实验,初步说明了游动放线菌阿卡波糖胞外代谢相关基因与阿卡波糖合成、类似物积累之间的关系,为解析阿卡波糖的胞外代谢途径奠定了基础。

关键词：游动放线菌阿卡波糖胞外代谢酶活检测基因敲除

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例谈相对运动类连接体问题的处理方法

高中数理化 2023年第16期 32-33页

作者：赵芹芹山东省枣庄市第三中学

连接体问题是物理问题中的重要类型.当连接体间有相对运动时,要考虑它们的位移关系、速度关系、加速度关系以及受力关系.1相向运动类.相向运动类连接体问题中,两物体的运动方向相反,两物体的运动速度和加速度大小相等、方向相反,两物体... 详细信息

连接体问题是物理问题中的重要类型.当连接体间有相对运动时,要考虑它们的位移关系、速度关系、加速度关系以及受力关系.1相向运动类.相向运动类连接体问题中,两物体的运动方向相反,两物体的运动速度和加速度大小相等、方向相反,两物体的位移大小相等、方向相反,解答该类问题一般采用隔离法.

关键词：相向运动相对运动连接体隔离法位移关系加速度例谈

SnO2基微纳材料的制备及光催化、气敏性质研究

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SnO2基微纳材料的制备及光催化、气敏性质研究

作者：赵芹芹济南大学

学位级别：硕士

半导体微纳材料被广泛的应用于有机污染物的降解、易燃易爆和有毒气体的监测。SnO作为一种重要的n型宽禁带的半导体材料,因其具有独特的光化学性质被广泛的应用在气敏传感器和光催化等领域。半导体光催化技术与气体敏感响应具有共同之处... 详细信息

半导体微纳材料被广泛的应用于有机污染物的降解、易燃易爆和有毒气体的监测。SnO作为一种重要的n型宽禁带的半导体材料,因其具有独特的光化学性质被广泛的应用在气敏传感器和光催化等领域。半导体光催化技术与气体敏感响应具有共同之处,它们均属于表面反应,均表现为吸附脱附反应进程。本文以SnO为研究对象,并探索通过掺杂改性、复合等策略,来进一步改善其气敏性能和光催化性能,主要研究成果如下:1.通过简单的水热法生长SnO纳米球和Zn-doped SnO纳米片结构,并探究其最佳生长条件。我们通过Zn掺杂使得SnO纳米球变成了超薄的纳米片结构,这种Zn-doped SnO纳米片对乙二醇表现出较高的选择性和灵敏度,对100ppm的乙二醇响应达到90,远高于纯相SnO的灵敏度。Zn-doped SnO对甲基橙有良好的光催化降解性能,远高于纯相SnO的降解效率。2.通过简单的水热法直接在碳布上生长SnO/FeO纳米复合材料,并进行了光催化性能的测试。测试结果发现,与纯相SnO和FeO相比,SnO/FeO复合材料对亚甲基蓝的光催化性能有了一定的提高,而且它具有良好的光催化循环特性。我们进而提出了SnO/FeO纳米复合材料的改善光催化性能的机理。3.通过简单的水热法合成了ZnSnO微米材料,并探索ZnSnO的最佳生长条件。测试结果发现八面体结构的ZnSnO(24 h)对三乙胺表现出较高的灵敏度和选择性,对100 ppm三乙胺灵敏度达到38,远高于立方块结构的ZnSnO(16 h)。另外,ZnSnO(24 h)催化剂降解速度最快,照射时间60 min时降解率达到了90%左右,而此时ZnSnO(16 h)和ZnSnO(36 h)的降解效率仅达到40%和50%。空心立方块结构的ZnSnO对三种有机染料(MB,MO,RhB)均有良好的降解性能,其中对MB的降解性能最好,在紫外光照射20min时就降解达到了95%,对RhB和MO的降解仅为70%和80%,而其前驱物ZnSn(OH)6对MB的降解仅20%。

关键词：二氧化锡锡酸锌掺杂气敏性能光催化

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护理管理者职业生涯成功现况及影响因素分析

中国护理管理 2024年第5期24卷 736-740页

作者：赵芹芹徐士婷毕可嘉姚秀钰中华护理学会国际部北京市100044 中国医学科学院北京协和医学院护理学院

目的:调查护理管理人员职业生涯成功的现状,分析其影响因素,为制定和建立优化护理管理人员执业环境的相关策略提供依据。方法:通过便利抽样,选取来自21个省份的1804名护理管理人员作为调查对象。使用一般资料调查表、护士执业环境测评... 详细信息

目的:调查护理管理人员职业生涯成功的现状,分析其影响因素,为制定和建立优化护理管理人员执业环境的相关策略提供依据。方法:通过便利抽样,选取来自21个省份的1804名护理管理人员作为调查对象。使用一般资料调查表、护士执业环境测评量表和职业生涯成功量表进行调查。采用多元线性回归分析,探究护理管理者职业成功的影响因素。结果:共回收有效问卷1804份。护士执业环境测评量表得分为(83.38±14.99)分,职业生涯成功量表得分为(39.47±8.21)分。多元线性回归分析结果显示,护理管理人员的学历、职位、学术组织兼职以及执业环境是影响职业成功的主要因素(P<0.05),共同解释了职业成功总变异的28.6%。结论:护理管理人员的职业生涯成功处于较高水平,改善执业环境有助于其职业生涯成功水平的继续提升。

关键词：职业成功执业环境影响因素护理管理

钝齿棒杆菌SYPH5-8合成L-精氨酸的代谢工程改造

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钝齿棒杆菌SYPH5-8合成L-精氨酸的代谢工程改造

作者：赵芹芹江南大学

学位级别：硕士

L-精氨酸(L-Arginine，简称L-Arg)作为具有多种生理功能的半必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和化工等领域。钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPH5-8是经过多级诱变筛选获得的能够利用糖质原料发酵生产L-精氨酸的菌株，本文以SY... 详细信息

L-精氨酸(L-Arginine，简称L-Arg)作为具有多种生理功能的半必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和化工等领域。钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPH5-8是经过多级诱变筛选获得的能够利用糖质原料发酵生产L-精氨酸的菌株，本文以SYPH5-8为出发菌株，运用代谢工程手段，对其L-精氨酸合成途径的限速步骤实施改造，探讨改造后菌株发生代谢变化的机制，强化L-精氨酸的合成途径。主要研究结果如下： (1)考察L-精氨酸对SYPH5-8中N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamate kinase,CcNAGK, argB)的反馈抑制情况，测得其半数反馈抑制常数(I0.5)为1.36mM，当L-精氨酸添加量达5mM时，CcNAGK的酶活力仅保持3.0%，以上结果表明：SYPH5-8虽然经过多级诱变及L-精氨酸结构类似物抗性筛选，但仍未解除L-精氨酸对CcNAGK的反馈抑制作用。将CcNAGK与已知蛋白质晶体结构的N-乙酰谷氨酸激酶(L-精氨酸敏感型)进行氨基酸序列的同源性比对，选择14个可能与L-精氨酸结合相关的位点进行体外突变，发现209位精氨酸突变为丙氨酸(R209A)或268位组氨酸突变为天冬酰胺(H268N)不改变酶的催化活性，同时突变体的I0.5提高约40倍，当添加15mM L-精氨酸时，突变体的酶活力可保持99%以上，以上结果表明：CcNAGK中R209A或H268N位点突变可解除L-精氨酸对其反馈抑制作用。 (2)在SYPH5-8基因组的argB中分别精确引入R209A及H268N突变点，对获得的重组菌SYPH5-8-NAGKR209A(简称：R-8)及SYPH5-8-NAGKH268N(简称：H-7)进行发酵特性研究，发现其生长缓慢，L-精氨酸的积累速率降低，但L-精氨酸合成途径的中间代谢产物(L-鸟氨酸及L-瓜氨酸)大量积累。对重组菌的arg基因簇进行转录分析，发现argG及argH的转录水平显著降低，同时酶活力也相应降低，推断其是L-瓜氨酸及L-鸟氨酸积累的关键因素。 (3)为加强表达argGH基因，构建了重组质粒pDXW-10-argGH，转化R-8及H-7获得重组菌R-8-argGH (简称：R-8-GH)及H-7-argGH (简称：H-7-GH)。发酵64h后，H-7-GH较H-7的L-精氨酸产量提高了1.4倍，L-鸟氨酸及L-瓜氨酸含量分别降低了79.3%及82.8%，R-8-GH表现为相同的趋势。H-7-GH与SYPH5-8相比，发酵时间缩短16h，L-精氨酸生产能力提高84.6%，糖酸转化效率提高1倍，主要副产物L-赖氨酸及L-异亮氨酸分别降低了51.4%及53.7%。优化了重组菌发酵培养基中的主要营养组分，当添加14g/L酵母粉及8g/L牛肉膏时，菌体生物量为19.9g/L，较优化前(14.1g/L)提高41.1%，L-精氨酸产量为45.1g/L，较优化前(30.1g/L)提高49.8%。在此基础上优化了碳氮源的补加方式，发酵80h，菌体生物量为22.7g/L，L-精氨酸产量为51.7g/L。

关键词：钝齿棒杆菌 N-乙酰谷氨酸激酶 L-精氨酸反馈抑制 argGH

麦芽糖及转运蛋白对游动放线菌生产阿卡波糖的影响

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基因组学与应用生物学 2019年第10期38卷 4536-4544页

作者：解慧欣赵芹芹白林泉上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室

阿卡波糖(Acarbose)作为α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物,因其高效、安全而被广泛应用于2型糖尿病的治疗,工业上主要采用游动放线菌(Actinoplanes spp.)发酵生产。解析阿卡波糖生物合成过程中的分子机制并进一步提升产量是目前亟待解决的问... 详细信息

阿卡波糖(Acarbose)作为α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物,因其高效、安全而被广泛应用于2型糖尿病的治疗,工业上主要采用游动放线菌(Actinoplanes spp.)发酵生产。解析阿卡波糖生物合成过程中的分子机制并进一步提升产量是目前亟待解决的问题。本研究首先考察了不同麦芽糖浓度对阿卡波糖产量的影响,发现随着麦芽糖浓度提高,阿卡波糖产量呈先上升后下降的趋势,最适浓度为50 g/L。同时,检测了不同麦芽糖浓度下阿卡波糖合成相关基因的转录水平,发现麦芽糖浓度提高显著促进转运蛋白基因acbW的转录。为了进一步考察acbW基因对阿卡波糖产量的影响,在Actinoplanes sp.SE50/110中将其缺失后,获得的突变株生长减弱,且无阿卡波糖积累,而分别加强表达acbW和acbWXY基因后,阿卡波糖产量提高了6.4%和8%。该研究表明,acbWXY编码的转运蛋白在阿卡波糖的生产过程中至关重要,且强化该外运途径可有效提高阿卡波糖产量,为菌株高产改造提供了重要依据。

关键词：阿卡波糖游动放线菌麦芽糖 ABC转运蛋白

分析舒适护理在小儿先天性心脏病术后镇静的应用价值

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世界最新医学信息文摘 2019年第90期19卷 327-327页

作者：赵芹芹江苏省徐州市儿童医院

目的本次研究主要针对小儿先天性心脏病术后有效运用舒适护理的镇静效果开展分析。方法在2018年3月至2019年3月时间段内开展本次调查研究,调查研究对象为我院接收治疗的先天性心脏病手术患儿86例,采取随机分组的方法将患者分为研究组与... 详细信息

目的本次研究主要针对小儿先天性心脏病术后有效运用舒适护理的镇静效果开展分析。方法在2018年3月至2019年3月时间段内开展本次调查研究,调查研究对象为我院接收治疗的先天性心脏病手术患儿86例,采取随机分组的方法将患者分为研究组与普通组,研究组的43例患儿开展舒适护理,普通组的43例患儿开展普通护理。结果研究组患者的镇静与镇痛效果均好于普通组,P<0.05。结论先天性心脏病手术患儿在术后开展舒适护理干预,可取得更好的镇静效果,同时有效降低镇痛度。

关键词：先天性心脏病舒适护理镇静

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阿卡波糖生物合成调控蛋白的钓取与功能解析

微生物学报 2021年第11期61卷 3667-3685页

作者：汪雪梅翁倩卉赵芹芹白林泉上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

【目的】发现游动放线菌Actinoplanes sp.SE50/110中阿卡波糖生物合成的调控因子,并提高其产量。【方法】首先,利用DNA亲和层析技术,钓取与阿卡波糖生物合成基因簇2个双向启动子区域结合的调控蛋白。然后,在阿卡波糖产生菌QQ-2中强化表... 详细信息

【目的】发现游动放线菌Actinoplanes sp.SE50/110中阿卡波糖生物合成的调控因子,并提高其产量。【方法】首先,利用DNA亲和层析技术,钓取与阿卡波糖生物合成基因簇2个双向启动子区域结合的调控蛋白。然后,在阿卡波糖产生菌QQ-2中强化表达或敲除这些调控蛋白编码基因,进行体内功能验证。同时,利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达获得可溶性蛋白,通过凝胶阻滞实验验证蛋白与启动子区域的结合能力。【结果】经DNA亲和层析及蛋白质质谱分析,钓取出9个与双向启动子PWV和PAB结合的调控蛋白。在QQ-2中分别强化表达和缺失这9个调控基因后发现,基因ACPL_1889的强化表达使阿卡波糖产量提高25%,而该基因的缺失使产量降低22%;基因ACPL_5445、ACPL_3989的强化表达使阿卡波糖产量分别降低12%和39%,而这两个基因的缺失使产量分别提高15%和8%。对阿卡波糖生物合成基因转录水平的检测发现,强化表达基因ACPL_1889使acbA、acbB、acbW、acbV的转录水平升高,而缺失该基因使这4个基因的转录水平降低;敲除基因ACPL_5445使这4个基因转录水平均有提高;强化表达基因ACPL_3989使这4个基因的转录水平均下降,而其敲除使acbW和acbA的转录水平分别提高了约100倍和40倍。在凝胶阻滞实验中,ACPL_1889与ACPL_3989均能与acb基因簇的启动子区域结合。最后将正调控基因的强化表达和负调控基因的敲除进行组合,使阿卡波糖产量提升32%。【结论】本研究发现了9个与阿卡波糖生物合成基因簇的启动子区域结合的调控蛋白,通过体内、体外实验证明ACPL_1889为阿卡波糖生物合成的正调控因子、ACPL_5445和ACPL_3989为负调控因子,不但为揭示阿卡波糖生物合成的转录调控机制奠定了基础,而且这些调控基因的改造显著提升了阿卡波糖的产量。

关键词：阿卡波糖 DNA亲和层析转录调控凝胶阻滞实验