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大肠杆菌细胞抽提物制备方案的简化与优化

生物工程学报 2013年第4期29卷 532-535页

作者：郭新娟权春善赵朋超王丽娜范圣第中国科学院大连化学物理研究所辽宁大连116023 中国科学院大学北京100049 大连民族学院生物技术与资源利用国家民委-教育部重点实验室辽宁大连116600

无细胞蛋白表达系统是一种将目的蛋白在体外进行表达的新技术和新方法,已广泛应用到蛋白质组学、蛋白质结构和功能等领域的研究中。在无细胞蛋白表达系统中,细胞抽提物的制备是关键因素之一。通过对大肠杆菌细胞抽提物制备过程中离心速... 详细信息

无细胞蛋白表达系统是一种将目的蛋白在体外进行表达的新技术和新方法,已广泛应用到蛋白质组学、蛋白质结构和功能等领域的研究中。在无细胞蛋白表达系统中,细胞抽提物的制备是关键因素之一。通过对大肠杆菌细胞抽提物制备过程中离心速度、预孵化和透析等参数的考察,利用绿色荧光蛋白作为报告蛋白,可以得到一个细胞抽提物制备的简化方案。采用相对低的转速(12 000×g,10 min),简易空孵化即可制备出活性高的细胞抽提物,用于无细胞体系蛋白表达,其表达的绿色荧光蛋白产量为209μg/mL。与传统的大肠杆菌细胞抽提物S30相比较,新方案将使时间与成本节省62%,产量是传统方法的2.6倍,使无细胞蛋白表达技术的操作快速、高通量的优势更加明显。

关键词：蛋白质表达无细胞表达系统细胞抽提物大肠杆菌体外表达

氮源和碳源对解淀粉芽孢杆菌Q-426抗菌脂肽合成的影响

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中国生物工程杂志 2012年第10期32卷 50-56页

作者：赵朋超权春善金黎明王丽娜范圣第中国科学院大连化学物理研究所大连116023 中国科学院研究生院北京100049 大连民族学院生命科学学院大连116600 国家民委教育部重点实验室大连116600

微生物来源的环状脂肽在生物农药以及医学领域极具应用潜力。通过测量抑菌活性并利用反相高效液相色谱(RP-HPLC),液相质谱联用(HPLC-MS)和串联质谱(MS/MS)技术检测抗菌脂肽组分的变化研究了氮(N)源、碳(C)源和培养基中的初始pH值对解淀... 详细信息

微生物来源的环状脂肽在生物农药以及医学领域极具应用潜力。通过测量抑菌活性并利用反相高效液相色谱(RP-HPLC),液相质谱联用(HPLC-MS)和串联质谱(MS/MS)技术检测抗菌脂肽组分的变化研究了氮(N)源、碳(C)源和培养基中的初始pH值对解淀粉芽孢杆菌Q-426菌株中抗菌脂肽bacillomycin D和fengycins合成的影响,从而为进一步研究它们生物合成的基因调控以及更有目的性提高产量提供理论依据。结果表明:L-组氨酸、L-赖氨酸、甘油、山梨醇以及培养基中的[OH]-均能促进脂肽bacillomycin D的合成,但它们在该实验菌株抗菌脂肽bacillomycinD合成途径中的调控靶点有所不同。

关键词：解淀粉芽孢杆菌Q-426 Bacillomycin D Fengycins 碳源氮源

bmy基因敲除对解淀粉芽孢杆菌Q-426溶血性及抗菌活性的影响

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中国生物工程杂志 2014年第3期34卷 56-60页

作者：陶思美郑维赵朋超周伟权春善范圣第大连民族学院生命科学学院大连116600 国家民委教育部重点实验室大连116600 河南科技大学医学技术与工程学院洛阳471023

Iturin家族环脂肽对于红色毛癣菌等病原真菌具有较强的抑菌活性,有潜力成为治疗皮肤疾病的新型抗真菌药物。解淀粉芽孢杆菌Q-426菌株能够产生环脂肽fengycins和iturin家族的bacillomycin D,但该菌株发酵液具有溶血活性。为确定bacillomy... 详细信息

Iturin家族环脂肽对于红色毛癣菌等病原真菌具有较强的抑菌活性,有潜力成为治疗皮肤疾病的新型抗真菌药物。解淀粉芽孢杆菌Q-426菌株能够产生环脂肽fengycins和iturin家族的bacillomycin D,但该菌株发酵液具有溶血活性。为确定bacillomycin D是否为引发溶血作用的主要物质,本文利用同源重组基因敲除技术,构建解淀粉芽孢杆菌bmy基因缺失菌株,抑制bacillomycin D的合成,研究对其溶血性及抗菌活性的影响。突变菌株发酵液中未检测到bacillomycin D产生,且发酵液的溶血性及抗菌活性明显减小,表明bacillomycin D与该菌的溶血活性及抑菌活性密切相关。

关键词：环脂肽基因敲除 bmy基因溶血性抗菌活性

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枯草芽孢杆菌抗菌肽生物合成的研究进展

中国生物工程杂志 2010年第10期30卷 108-113页

作者：赵朋超王建华权春善范圣第中国科学院大连化学物理研究所大连116023 中国科学院研究生院北京100049 大连民族学院生命科学学院大连116600

革兰氏阳性菌模式生物——枯草芽孢杆菌能分泌多种肽类及由肽类衍生的抗菌活性物质,按合成途径不同,可分为核糖体肽和非核糖体肽。其中,非核糖体肽分子量较小,一般为3000Da以下,其生物合成是通过多功能复合酶系——非核糖体肽链合成酶... 详细信息

革兰氏阳性菌模式生物——枯草芽孢杆菌能分泌多种肽类及由肽类衍生的抗菌活性物质,按合成途径不同,可分为核糖体肽和非核糖体肽。其中,非核糖体肽分子量较小,一般为3000Da以下,其生物合成是通过多功能复合酶系——非核糖体肽链合成酶来完成的,多发生在菌体生长停止之后;而核糖体肽分子量较大,其合成多于菌体快速生长时期。非核糖体肽链合成酶和核糖体肽的合成及其调控均需基因参与,而这一系列基因就构成了各种抗菌肽生物合成的基因簇。对核糖体肽和非核糖体肽的生物合成及其相关调控机制进行了综述。

关键词：非核糖体肽和核糖体肽基因簇生物合成

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DKP对3株病原菌生物膜的抑制作用研究

中国生物工程杂志 2011年第8期31卷 61-65页

作者：王建华权春善赵朋超范圣第中国科学院大连化学物理研究所大连116023 中国科学院研究生院北京100049 大连民族学院生命科学学院大连116600

生物膜的存在使一些由病原菌引发的疾病变得更加难以治疗。经研究发现一种环二肽物质DKP——cyclo(Pro-Phe)能够抑制这3株病原菌(Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa,Candida albicans)生物膜的形成。通过对不同浓度DKP作用... 详细信息

生物膜的存在使一些由病原菌引发的疾病变得更加难以治疗。经研究发现一种环二肽物质DKP——cyclo(Pro-Phe)能够抑制这3株病原菌(Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa,Candida albicans)生物膜的形成。通过对不同浓度DKP作用下所形成的生物膜进行结晶紫定量、菌落计数分析和结构显微分析表明:在DKP的浓度达到10 mg/ml时,***和***的生物膜几乎消失;在DKP的浓度达到12 mg/ml时,***的生物膜被显著抑制。这一发现为寻找新型的生物膜抑制剂治愈顽固疾病带来了新的希望。

关键词：生物膜病原菌 DKP 生物膜抑制剂

解淀粉芽孢杆菌Q-426 Bacillomycin D的分离纯化及其抗肿瘤活性

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生物工程学报 2018年第2期34卷 235-245页

作者：权春善刘静周伟郑维金黎明赵晶赵朋超范圣第大连民族大学生命科学学院辽宁大连116600 河南科技大学医学技术与工程学院河南洛阳471023

环脂肽化合物因其独特的结构特点和生物活性在医药领域具有广泛的应用前景。本研究旨在从解淀粉芽孢杆菌Q-426发酵液中分离纯化获得高纯度的环脂肽单体,并对分离得到的环脂肽C-15 Bacillomycin D和C-16Bacillomycin D的抗肿瘤活性及机... 详细信息

环脂肽化合物因其独特的结构特点和生物活性在医药领域具有广泛的应用前景。本研究旨在从解淀粉芽孢杆菌Q-426发酵液中分离纯化获得高纯度的环脂肽单体,并对分离得到的环脂肽C-15 Bacillomycin D和C-16Bacillomycin D的抗肿瘤活性及机制进行初步研究。首先,联合使用酸沉淀和双树脂层析去除大量杂质,然后通过制备型HPLC分离得到纯度较高的两种环脂肽,经ESI-MS/MS对其进行结构鉴定,分别确定为C-15Bacillomycin D与C-16 Bacillomycin D。其次,将两种环脂肽单体及其1:1混合液(摩尔比)按不同浓度梯度作用于人癌细胞(Hela、MG、Hep-G2、HT-29),结果表明环脂肽对Hela与MG细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性,长链环脂肽的抑制率较短链环脂肽略高。最后,采用细胞划痕实验和PI染色法考察了C-16 Bacillomycin对细胞侵袭与迁移能力、细胞凋亡和周期的影响,结果显示,C-16 Bacillomycin D可有效影响细胞的迁移能力,诱导细胞凋亡呈浓度依赖性,且阻滞细胞G_0G_1期。

关键词：解淀粉芽孢杆菌Q-426 C-15 Bacillomycin D C-16 Bacillomycin D 抗肿瘤活性

副猪嗜血杆菌新型微量凝集试验抗体检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2018年第9期40卷 806-811页

作者：薛云王乐王臣赵朋超司丽芳赵战勤河南科技大学医学技术与工程学院微生物检验实验室河南洛阳471023 河南科技大学动物科技学院兽医生物制品工程实验室河南洛阳471023

为建立国内流行血清型副猪嗜血杆菌的新型微量凝集试验抗体检测方法(MAT),本研究以副猪嗜血杆菌4型、5型、12型和13型为抗原,分别对其MAT方法进行了最佳反应条件筛选、特异性、敏感性和重复性试验,以及疫苗免疫样品和临床样本检测。MAT... 详细信息

为建立国内流行血清型副猪嗜血杆菌的新型微量凝集试验抗体检测方法(MAT),本研究以副猪嗜血杆菌4型、5型、12型和13型为抗原,分别对其MAT方法进行了最佳反应条件筛选、特异性、敏感性和重复性试验,以及疫苗免疫样品和临床样本检测。MAT试验结果显示,4型、5型、12型和13型凝集抗原的最佳反应浓度介于1.5×10~9 cfu/mL～2.0×10~9 cfu/mL,最佳反应温度37℃,最佳反应时间为6h～8h。4种型的MAT方法对猪巴氏杆菌病等6种细菌性疾病和猪瘟等5种病毒性疾病阳性血清的检测结果均为阴性,4种方法之间有轻微的交叉反应,但其抗体效价均不高于1∶4 (阴性临界值)。4种型的MAT方法比相应试管凝集方法的敏感性提高了2～4倍,重复性试验结果显示该方法检测副猪嗜血杆菌4种型变异系数均小于10%,重复性良好。利用该方法检测临床样品,并与国家标准套式PCR方法对比,结果显示二者阳性符合率为82.1%。疫苗免疫抗体检测结果显示,4种型的MAT方法均能检测到商品化疫苗免疫猪14 d的血清抗体,可用于疫苗免疫的抗体评价。对临床样品的检测结果显示,断奶仔猪、保育仔猪和经产母猪的总阳性率分别为12.3%、49.3%和69.8%,提示保育期仔猪的合群可能导致了猪群的大量感染。本研究为副猪嗜血杆菌病的疫苗抗体评价和流行病学监测提供了一种简便经济可行的方法。

关键词：猪副猪嗜血杆菌微量凝集试验抗体

基于PARMS技术的结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB分子标记的开发

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生物工程学报 2021年第7期37卷 2503-2512页

作者：刘晓慧祖向阳王珍珍赵朋超高蕾赵战勤薛云河南科技大学医学技术与工程学院河南洛阳471023 河南科技大学第一附属医院检验科河南洛阳471023 河南科技大学动物科技学院河南洛阳471023

文中旨在建立结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的荧光分子标记,为分子药物敏感性试验提供简便、可靠的基因分型检测方法。对比分析利福平耐药菌株rpoB基因531、526、516、511、513等氨基酸位点的基因突变与敏感菌株中等位基因的序列差异... 详细信息

文中旨在建立结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的荧光分子标记,为分子药物敏感性试验提供简便、可靠的基因分型检测方法。对比分析利福平耐药菌株rpoB基因531、526、516、511、513等氨基酸位点的基因突变与敏感菌株中等位基因的序列差异,结合PARMS技术(Penta-primer amplification refractory mutation system),建立rpoB基因的荧光分子标记。利用其对104例结核分枝杆菌临床分离株进行检测,经Sanger测序验证,正确率100%。并采用比例法药敏试验对这104份样本进行了利福平耐药性鉴定,与分子标记结果相符率为94.23%。结果表明,分子标记有较强可靠性,能检出表型药敏无法测出的低浓度耐药样本(511/533单位点突变)。建立的11组荧光分子标记能覆盖92%–96%的利福平耐药菌株rpoB基因突变类型,为快速检测结核分枝杆菌利福平耐药提供新思路。

关键词：结核分枝杆菌利福平耐药 rpoB基因 PARMS技术比例法药敏

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呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展

中国疫苗和免疫 2018年第2期24卷 237-242页

作者：祖向阳高伟娜杜喆赵朋超胡志刚薛云河南科技大学医学技术与工程学院

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染如支气管炎和肺炎的常见病原体,导致患者住院治疗甚至死亡。虽然RSV疫苗的研究已有近60年历史,但依然没有商品化的疫苗可用。近年来,随着RSV分子生... 详细信息

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染如支气管炎和肺炎的常见病原体,导致患者住院治疗甚至死亡。虽然RSV疫苗的研究已有近60年历史,但依然没有商品化的疫苗可用。近年来,随着RSV分子生物学研究的深入和新型疫苗设计策略的应用,RSV疫苗研究进展迅速。目前正在研制多种针对不同免疫对象的候选疫苗,包括减毒活疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗和纳米颗粒疫苗等,其中亚单位疫苗和纳米颗粒疫苗适用于孕妇和老人,减毒活疫苗、载体疫苗和部分亚单位疫苗有望用于婴幼儿。本文介绍了RSV的生物学特性、RSV疫苗研究面临的困难和正在进行临床试验的RSV候选疫苗的研究进展,为RSV疫苗的研发提供参考和借鉴。

关键词：呼吸道合胞病毒减毒活疫苗亚单位疫苗载体疫苗纳米颗粒疫苗