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奶山羊SCD基因CDS区的克隆、序列分析及过表达

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中国农业科学 2012年第24期45卷 5091-5101页

作者：石恒波罗军朱越王紫骞赵旺生西北农林科技大学动物科技学院/陕西省农业分子生物学重点实验室

【目的】研究奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(stearoyl-CoA desaturase,SCD)在乳腺上皮细胞中对不饱和脂肪酸合成过程相关基因的调控及对细胞脂肪酸组成的影响。【方法】用RT-PCR方法从西农萨能羊乳腺组织中扩增SCD基因,进行序列分析和... 详细信息

【目的】研究奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(stearoyl-CoA desaturase,SCD)在乳腺上皮细胞中对不饱和脂肪酸合成过程相关基因的调控及对细胞脂肪酸组成的影响。【方法】用RT-PCR方法从西农萨能羊乳腺组织中扩增SCD基因,进行序列分析和组织表达谱分析;构建重组腺病毒质粒,进行包装和扩增后,感染体外培养的奶山羊原代乳腺上皮细胞,实时定量检测相关基因的表达,western blotting检测蛋白变化,气相色谱-质谱联用分析细胞内脂肪酸组成变化。【结果】①获得了全长1 080 bp的山羊乳腺SCD基因CDS(GenBank登录号:GU947654)并对其进行了生物信息学分析;②奶山羊SCD基因在乳腺、肺和皮下脂肪组织中高表达,而在心脏、瘤胃和卵巢组织中的表达量较低;③成功构建了奶山羊SCD基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒液,重组腺病毒感染原代乳腺上皮细胞后,检测结果表明细胞中SCD基因过表达极显著,FASN、H-FABP、LEPR和LXRα等基因表达下调,而PPARγ和LPL基因的表达量显著性增加;④棕榈酸和硬脂酸的含量下降,不饱和脂肪酸含量上升。【结论】SCD基因在奶山羊乳腺中发挥着重要作用,FASN、H-FABP、LEPR、LXRα、PPARγ和LPL基因的表达与其相关,这些基因共同影响乳脂中脂肪酸的组成。

关键词：奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶乳腺上皮细胞腺病毒过表达

西农萨能奶山羊泌乳中期和后期乳腺组织差异基因的筛选

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畜牧兽医学报 2010年第1期41卷 16-21页

作者：武会娟罗军赵旺生王伟西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100 北京市理化分析测试中心北京100193

旨在利用抑制性削减杂交（SSH）技术筛选西农萨能奶山羊泌乳中期和后期的差异表达基因,并用实时定量PCR（Q-PCR）分析差异基因的表达丰度,探讨奶山羊不同泌乳阶段乳腺组织的基因表达规律。本研究以西农萨能奶山羊泌乳中期和后期乳腺组织... 详细信息

旨在利用抑制性削减杂交（SSH）技术筛选西农萨能奶山羊泌乳中期和后期的差异表达基因,并用实时定量PCR（Q-PCR）分析差异基因的表达丰度,探讨奶山羊不同泌乳阶段乳腺组织的基因表达规律。本研究以西农萨能奶山羊泌乳中期和后期乳腺组织的mRNA互为检测子（Tester）和驱动子（Driver）构建cDNA消减文库（M-L和L-M）,随机挑选克隆测序,进行序列比对分析,并检测部分差异基因在乳腺组织中的表达丰度。结果,成功构建了泌乳中期和后期的cDNA文库,随机挑选30个克隆测序,得到M-L和L-M文库中与细胞凋亡、抗氧化、脂类代谢、能量代谢等生理过程相关的差异基因,对其中的6个基因进行实时定量分析,发现5个均为阳性克隆,表达水平增加了1.3~5.5倍不等。结果表明,利用SSH技术成功构建了泌乳中期和后期乳腺组织正反向消减cDNA文库,筛选出24个差异基因,为进一步研究奶山羊乳腺组织基因调控机理奠定了基础。

关键词：西农萨能羊乳腺组织抑制性削减杂交差异表达基因实时定量PCR

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奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养及鉴定

生物工程学报 2010年第8期26卷 1123-1127页

作者：王桢罗军王伟赵旺生林先滋西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室杨凌712100

应用组织块培养法和高密度培养、连续传代法建立西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞体外培养体系,通过生长曲线绘制、核型分析、免疫荧光染色(角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白)、油红染色及β-酪蛋白基因的RT-PCR分析进行培养细胞鉴... 详细信息

应用组织块培养法和高密度培养、连续传代法建立西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞体外培养体系,通过生长曲线绘制、核型分析、免疫荧光染色(角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白)、油红染色及β-酪蛋白基因的RT-PCR分析进行培养细胞鉴定。实验结果表明细胞生长曲线为典型的S型,染色体数目众数为60,细胞角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白表达均呈阳性,油红染色后可见细胞质内的脂滴,且细胞表达酪蛋白mRNA。说明运用本方法培养的细胞为正常的乳腺上皮细胞,并具有一定的泌乳功能。

关键词：奶山羊乳腺上皮细胞原代培养

西农萨能奶山羊脂联素受体1基因(AdipoR1)cDNA克隆、表达及功能分析

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农业生物技术学报 2015年第1期23卷 80-88页

作者：赵旺生罗军张天颖余康西北农林科技大学动物科技学院/陕西省农业分子生物学重点实验室

脂联素(adiponectin)具有改善胰岛素敏感性,调节脂肪酸代谢和参与细胞增殖和分化的功能。本研究参考Gen Bank中已收录的牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)等物种脂联素受体1基因(adiponectin receptor 1,Adipo R1)... 详细信息

脂联素(adiponectin)具有改善胰岛素敏感性,调节脂肪酸代谢和参与细胞增殖和分化的功能。本研究参考Gen Bank中已收录的牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)等物种脂联素受体1基因(adiponectin receptor 1,Adipo R1)序列的同源比对结果,设计和合成PCR扩增引物,采用反转录PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)Adipo R1的c DNA序列。结果显示,Adipo R1全长2 032 bp(Gen Bank登录号:HQ846828),包括开放阅读框(open reading frame,ORF)1 128 bp,3’非翻译区(untranslated regions,UTR)719 bp和5’UTR 185 bp,该基因编码375个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现,山羊与牛、猪(Sus scrofa)、小鼠和人的Adipo R1相似性较高,均在95%以上。蛋白质结构分析表明,其蛋白质的分子量为42.44 k D,等电点为7.19,含7个跨膜结构域,并且整个序列中不含信号肽。组织表达分析显示,该基因在肺中的表达量最高,小肠次之,在心脏中表达量最低,而其余8个组织中Adipo R1m RNA水平变化则比较平缓;奶山羊乳腺组织中Adipo R1表达量分析表明,Adipo R1的表达量在干奶期和泌乳盛期乳腺组织差异显著(P<0.05)。用不同浓度胰岛素(insulin)和催乳素(prolactin)处理奶山羊乳腺上皮细胞,结果发现,用胰岛素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量下调,在胰岛素浓度为50 nmo/L时效果最明显(P<0.01);用催乳素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量上升,在浓度为100 mg/m L时作用最明显(P<0.05),表明该基因在奶山羊乳腺上皮细胞中具有一定的调控作用。本研究为进一步揭示Adipo R1基因在奶山羊乳腺组织中的功能提供基础资料。

关键词：西农萨能奶山羊脂联素受体基因(AdipoR1) 基因克隆组织表达

牦牛Eppin基因CDS的克隆及其在附睾不同区段中的表达研究

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基因组学与应用生物学 2019年第8期38卷 3436-3442页

作者：赵旺生袁梦李鹏程刘泽林西南科技大学生命科学与工程学院

为了研究牦牛附睾组织中精子成熟的相关机理,并为探讨高原动物的生殖机制提供基本数据。本研究运用基因克隆技术对牦牛附睾Eppin基因CDS全长序列进行克隆,采用生物信息学方法进行分析,Eppin基因和编码序列特征进行了预测和分析。结果表... 详细信息

为了研究牦牛附睾组织中精子成熟的相关机理,并为探讨高原动物的生殖机制提供基本数据。本研究运用基因克隆技术对牦牛附睾Eppin基因CDS全长序列进行克隆,采用生物信息学方法进行分析,Eppin基因和编码序列特征进行了预测和分析。结果表明,牦牛Eppin基因的CDS含有一个405 bp长度的片段,由134个氨基酸编码;牦牛Eppin基因对应的蛋白分子量和理论等电点分别为15.09 ku和8.67 ku,其对应的氨基酸没有跨膜结构,归于近水性蛋白;25个α-螺旋、27个延伸链、2个β-折叠及80个无规则卷曲构成其蛋白质二级结构;牦牛Eppin基因编码氨基酸序列与黄牛、藏羚羊、绵羊等物种间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。本研究应用实时荧光定量PCR技术分析Eppin基因在附睾组织3个不同区段(头部,颈部和尾部)中的表达情况,荧光定量PCR结果显示,Eppin基因在牦牛附睾组织3个不同区段中均有不同程度的表达,在附睾头部中表达最高,颈部和尾部表达较低。本研究将为牦牛附睾精子成熟的机制和Eppin基因在牦牛附睾上皮细胞中的功能提供一定的基础数据。

关键词：牦牛 Eppin基因生物信息学附睾组织表达

色瓦绵羊VPS28基因的克隆、生物信息学分析及表达研究

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中国畜牧杂志 2023年第11期59卷 123-128页

作者：李蕊张馨宋天增潘城刘桂琼姜勋平孙宇赵旺生西南科技大学生命科学与工程学院四川绵阳621010 西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所西藏拉萨850009 华中农业大学动物科技学院湖北武汉430070 河南农业大学动物科技学院河南郑州450002

液泡分选相关蛋白28(Vacuolar Protein Sorting-associated Protein 28,VPS28)是内吞体分选转运复合体I(Endosomal Sorting Complex Required for Transport I,ESCRTI)的组成亚基之一,通过控制细胞内多泡体(MVBs)的形成来参与长链脂肪酸、甘油三酯和分泌蛋白的转运。为探究VPS28基因在色瓦绵羊育种繁殖中的作用,本实验克隆了色瓦绵羊VPS28基因并进行生物信息学分析,测定该基因在乳腺、肌肉、心脏、小肠等10个组织中的表达。结果显示:VPS28基因编码区长度为666 bp;VPS28蛋白序列全长221个氨基酸,相对分子质量为25484.25;等电点为5.37,是细胞内一种酸性亲水性蛋白,不具跨膜结构。VPS28基因在色瓦绵羊乳腺、心脏、小肠等10个组织中都有表达,其中在乳腺和小肠中的表达量显著高于肌肉、心脏等其他组织(P<0.0001),在肌肉组织中的表达量最低。研究结果表明:VPS28基因在乳腺组织中高表达,可能与色瓦绵羊产奶性状相关。这一研究结果为VPS28基因在色瓦绵羊产奶性状的功能研究提供了参考依据。

关键词： VPS28基因色瓦绵羊泌乳生物信息学分析

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西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因启动子的克隆及活性测定

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中国农业科学 2010年第3期43卷 640-647页

作者：张晓罗军李建华赵旺生王伟西北农林科技大学动物科技学院/陕西省农业分子生物学重点实验室

【目的】克隆测定西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase,FAS)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为奶山羊FAS基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】根据牛和人脂肪酸合酶基因启动子的同源序列以及西农萨能奶山羊... 详细信息

【目的】克隆测定西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase,FAS)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为奶山羊FAS基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】根据牛和人脂肪酸合酶基因启动子的同源序列以及西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因5′UTR区域,分别设计上、下游引物,以西农萨能奶山羊全血DNA为模板克隆启动子序列。依据生物信息学分析结果重设引物,将FAS启动子基因分段克隆并连接到荧光素酶表达载体PGL-3,与Psv-β-半乳糖苷酶对照载体共转染293、MCF-7细胞,进行荧光素酶活性检测和β-半乳糖苷酶的活性检测。【结果】FAS基因启动子序列全长2640bp,与牛、人FAS启动子序列同源性90%以上,包括数个潜在SP1、Ets、LSF等转录因子结合位点和CCAAT框、GC框。-1040—-340bp处可能包含启动子活性中心,通过启动子缺失片段试验将活性中心范围缩小至-721—-540bp之间。【结论】通过克隆FAS基因启动子区域,分析表明启动子前端存在负调控元件,找出了启动子最小活性中心。

关键词：西农萨能奶山羊 FAS启动子基因克隆活性测定

奶山羊催乳素受体基因CDS区的克隆和序列分析与腺病毒干扰载体的构建

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中国畜牧杂志 2015年第9期51卷 56-61页

作者：赵旺生罗军邱思源王紫骞西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室陕西杨凌712100

本文旨在克隆奶山羊催乳素受体（PrlR）基因CDS序列，在此基础上构建针对奶山羊PrlR的腺病毒干扰载体，为研究PrlR在奶山羊乳腺乳脂合成代谢中的功能与调控作用提供有效的RNA干扰工具。首先从西农萨能羊乳腺组织RNA中扩增得到完整CDS区... 详细信息

本文旨在克隆奶山羊催乳素受体（PrlR）基因CDS序列，在此基础上构建针对奶山羊PrlR的腺病毒干扰载体，为研究PrlR在奶山羊乳腺乳脂合成代谢中的功能与调控作用提供有效的RNA干扰工具。首先从西农萨能羊乳腺组织RNA中扩增得到完整CDS区序列，其CDS长为1746bp，包含581个氨基酸序列，GenBank登录号为JF966783；测序后进行序列分析和功能预测，奶山羊PrlR基因CDS区与其他反刍动物相应序列具有较高的同源性，其跨膜区为第236-258位氨基酸；然后根据测序得到的CDS序列，在线设计合成奶山羊PrlR的shRNA序列并成功构建重组干扰腺病毒载体；将这些载体在293细胞系中进行包装和扩繁，最终获取高滴度的腺毒，使用TCID50法检测病毒滴度为5．19×10^8PFU／mL。

关键词：催乳素受体克隆腺病毒 shRNA 奶山羊

灵芝孢子粉对去卵巢大鼠骨量、骨生物力学和骨代谢的影响

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中国骨质疏松杂志 2024年第3期30卷 374-378,384页

作者：罗添润孙继超王玮武会娟赵旺生西南科技大学生命科学与工程学院四川绵阳621010 北京实验动物研究中心北京102629

目的研究灵芝孢子粉对去卵巢骨质疏松大鼠的治疗作用。方法随机取39只SD雌性大鼠进行去卵巢手术建立骨质疏松模型,剩余20只进行假手术。饲养16周建模成功后随机从假手术大鼠中取10只设为空白组(C组),随机取30只去势大鼠分为模型组(M组)... 详细信息

目的研究灵芝孢子粉对去卵巢骨质疏松大鼠的治疗作用。方法随机取39只SD雌性大鼠进行去卵巢手术建立骨质疏松模型,剩余20只进行假手术。饲养16周建模成功后随机从假手术大鼠中取10只设为空白组(C组),随机取30只去势大鼠分为模型组(M组)、灵芝孢子粉低浓度组(BL组,400 mg/kg)和灵芝孢子粉高浓度组(BH组,1600 mg/kg),每日1次灌胃治疗,持续10周。比较各组大鼠的体重变化、脏器指数、股骨骨密度、骨小梁微观结构变化、骨小梁参数、骨生物力学性能、血清中骨代谢物水平。结果各组大鼠体重变化差异无统计学意义(P>0.05),肝、脾和胸腺的脏器指数差异无统计学意义(P>0.05),与C组相比,M组大鼠的子宫系数显著降低(P<0.01),而BL组与BH组大鼠的子宫系数显著高于M组(P<0.05)。与M组相比,BL组与BH组大鼠的股骨骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(***)、最大载荷、弯曲强度、弹性模量和血清中雌二醇水平(E2)均显著提升(P<0.05);而骨小梁分离度(***)、血清中骨钙素(OC)、骨碱性磷酸酶(BALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP⁃5b)水平均显著降低(P<0.01)。Micro⁃CT骨微结构图像显示M组大鼠骨小梁减少而稀疏,而BL组与BH组大鼠骨小梁增多而致密。结论灵芝孢子粉对去卵巢大鼠的骨质疏松有一定治疗作用,推测其通过改善内分泌功能提升雌激素水平,以此平衡骨吸收与骨形成,从而改善骨质量、提升骨强度、提高骨密度。

关键词：骨质疏松去卵巢大鼠灵芝孢子粉骨密度