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绵羊痘病毒A11R基因的优化表达及抗体间接ELISA方法的建立

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中国兽医科学 2022年第8期52卷 978-984页

作者：朱学亮赵志荀蒙学莲曾巧英甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

本研究旨在对免疫原性目的蛋白基因A11R优化表达的基础上建立羊痘血清学检测方法,为羊痘防控提供技术支撑。绵羊痘病毒A11R基因经密码子优化后合成目的基因,连入pET-28a(+)载体,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌,pET28a-A11R经鉴定后进行诱导... 详细信息

本研究旨在对免疫原性目的蛋白基因A11R优化表达的基础上建立羊痘血清学检测方法,为羊痘防控提供技术支撑。绵羊痘病毒A11R基因经密码子优化后合成目的基因,连入pET-28a(+)载体,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌,pET28a-A11R经鉴定后进行诱导表达。结果显示,经密码子优化后的A11R蛋白的表达量显著增加,更易从转化的大肠杆菌裂解上清液和经过复性的包涵体中大量纯化获得。将该蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,建立检测羊痘抗体的间接ELISA方法,并进行特异性和敏感性试验,用该方法与商业化试剂盒对临床样品进行检测。结果显示,A11R蛋白的最佳包被剂量为0.5μg/孔,待检血清最适稀释度为1∶100,家兔抗羊Ig G最适稀释度为1∶20 000。用建立的间接ELISA方法检测小反刍兽疫、羊口疮、口蹄疫的阳性血清,结果均为阴性,无交叉反应,具有良好的特异性。当羊痘阳性血清稀释到1∶1 600时抗体检测仍为阳性,具有较高的敏感性。用该ELISA方法与商业化试剂盒检测临床样品,符合率为98.71%,具有良好的一致性。上述结果表明,本研究建立了基于A11R蛋白的羊痘血清学免疫诊断方法,同时表明了密码子偏好性的优化可显著提高蛋白表达量。

关键词：绵羊痘病毒 A11R基因密码子优化诱导表达 ELISA方法

一组绵羊OLA Ⅰ蛋白与绵羊痘病毒多肽的复性组装

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生物工程学报 2022年第1期38卷 139-147页

作者：王战红赵志荀吴国华邓阳朱国强赵芳燕卢曾军张强中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

本研究旨在体外组装小尾寒羊OLA Ⅰ蛋白与绵羊痘病毒多肽复合物,筛选绵羊痘病毒CTL表位肽。首先克隆小尾寒羊OLA Ⅰ重链基因胞外区OLA Ⅰα-BSP和轻链基因OLA Ⅰ-β2m,将获得的轻、重链基因分别插入原核表达载体pET-28a(+)并转化至BL21(... 详细信息

本研究旨在体外组装小尾寒羊OLA Ⅰ蛋白与绵羊痘病毒多肽复合物,筛选绵羊痘病毒CTL表位肽。首先克隆小尾寒羊OLA Ⅰ重链基因胞外区OLA Ⅰα-BSP和轻链基因OLA Ⅰ-β2m,将获得的轻、重链基因分别插入原核表达载体pET-28a(+)并转化至BL21(DE3)细胞进行诱导表达,收集菌体超声破碎,过镍柱纯化获得一定纯度的OLA Ⅰ重链和轻链β2m包涵体蛋白,稀释复性法将获得的轻、重链包涵体蛋白与绵羊痘病毒多肽PV4按摩尔比为1︰1︰1的比例进行共复性,分子筛层析验证复性情况,ELISPOT试验评价OLA Ⅰ分子限制性多肽引起的T细胞免疫应答。结果表明,克隆获得的重、轻链基因正确表达,大小分别为36.3 kDa和16.7 kDa,分子筛和SDS-PAGE结果表明,绵羊痘病毒多肽PV4与OLA Ⅰ分子稳定结合,ELISPOT试验确定该多肽可刺激引起T细胞免疫应答。本研究建立了小尾寒羊OLA Ⅰ分子轻、重链的原核表达体系,实现该轻、重链与绵羊痘病毒多肽PV4的复性,确定了1个绵羊痘病毒CTL表位肽,为下一步解析该复合物的结构及对羊痘CTL表位筛选提供思路。

关键词： OLAⅠ 绵羊痘病毒分子筛 CTL表位

猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学及免疫学的研究进展

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安徽农业科学 2010年第13期38卷 6716-6719页

作者：吴国华赵志荀张强中国农业科学院兰州兽医研究所家畜病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

猪繁殖与呼吸综合征病毒是严重危害世界养猪业的病原,其分子生物学及感染机制的研究,对猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制非常重要。笔者对猪繁殖与呼吸综合征病毒的病原学特性、分子生物学特征、获得性免疫和免疫调节与逃避机制等方面进... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒是严重危害世界养猪业的病原,其分子生物学及感染机制的研究,对猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制非常重要。笔者对猪繁殖与呼吸综合征病毒的病原学特性、分子生物学特征、获得性免疫和免疫调节与逃避机制等方面进行了综述,以期为该病的深入研究提供参考。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学特征免疫学

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羊痘病毒P32蛋白的研究进展

中国畜牧兽医 2009年第10期36卷 129-132页

作者：赵志荀王建科张强中国农业科学院兰州兽医研究所家畜病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046 甘肃农业大学动物医学院兰州730070

P32蛋白是所有羊痘病毒具有的结构蛋白之一,含有重要的免疫原性决定簇。P32蛋白既是致病的关键因素,也是激发机体产生抗体并产生保护性免疫的主要成分。作者就羊痘病毒P32蛋白的基因组结构、抗原表位及P32蛋白应用于羊痘病毒诊断和免疫... 详细信息

P32蛋白是所有羊痘病毒具有的结构蛋白之一,含有重要的免疫原性决定簇。P32蛋白既是致病的关键因素,也是激发机体产生抗体并产生保护性免疫的主要成分。作者就羊痘病毒P32蛋白的基因组结构、抗原表位及P32蛋白应用于羊痘病毒诊断和免疫方面的研究进展作一综述。

关键词：羊痘病毒 P32蛋白诊断免疫

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蔗糖密度梯度离心技术纯化山羊痘病毒的研究

黑龙江畜牧兽医 2018年第11期 52-54,253页

作者：高顺平吴国华颜新敏赵志荀张强中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046 乌兰察布市冷冻精液站内蒙古乌兰察布012000

为了提纯细胞培养物中的山羊痘病毒（Goat pox virus,GTPV）,试验采用低速离心法去除大部分细胞碎片,之后加入聚乙二醇6000（PEG6000）沉淀病毒,用蔗糖密度梯度离心技术进行纯化,然后用双抗体夹心ELISA和电镜观察法对纯化的病毒进行检... 详细信息

为了提纯细胞培养物中的山羊痘病毒（Goat pox virus,GTPV）,试验采用低速离心法去除大部分细胞碎片,之后加入聚乙二醇6000（PEG6000）沉淀病毒,用蔗糖密度梯度离心技术进行纯化,然后用双抗体夹心ELISA和电镜观察法对纯化的病毒进行检测。结果表明：病毒得到有效富集,电镜观察可见完整病毒颗粒且背景清晰。说明蔗糖密度梯度离心技术可以有效纯化细胞培养物中的GTPV,且能保留其免疫原性。

关键词：山羊痘病毒蔗糖密度梯度离心病毒纯化聚乙二醇6000 电镜

绵羊痘病毒古浪县分离株H7R基因的克隆及其原核表达

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中国畜牧杂志 2016年第15期52卷 70-73页

作者：吴健朱海霞赵银龙吴国华赵志荀颜新敏张强李影吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 西北民族大学生命科学技术学院甘肃兰州730124

根据已发表的山羊痘福州株全基因组,以其H7R基因进行引物设计,从古浪株中提取绵羊痘全基因组首次克隆H7R基因。将目的片段插入p MD19-simple载体后使用Bam HI+Not I双酶切构建p ET-28a-H7R原核表达载体,经测序验证构建载体正确。将重组... 详细信息

根据已发表的山羊痘福州株全基因组,以其H7R基因进行引物设计,从古浪株中提取绵羊痘全基因组首次克隆H7R基因。将目的片段插入p MD19-simple载体后使用Bam HI+Not I双酶切构建p ET-28a-H7R原核表达载体,经测序验证构建载体正确。将重组质粒转化到Rosetta感受态通过IPTG诱导,SDS-PAGE检测,结果表明:在17 ku处出现明显条带,经过几次条件优化,H7R在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达。这为后续研究羊痘病毒的入侵及新型疫苗的研究奠定了基础。

关键词：羊痘病毒 H7R 基因克隆原核表达

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羊痘的诊断与疫苗研究进展

中国兽医杂志 2017年第6期53卷 86-88页

作者：李杨颜新敏吴国华李健叶奕优赵志荀朱海霞张志东张强中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心广东深圳518045

羊痘病毒粒子大小约为150 Kbp,分子量约为73-91 MDa。该病毒能引起羊的急性、热性、接触性传染病,因其病毒结构及其发病症状和人类的天花很像,又称“羊天花”。根据分离的毒株不同,羊群的发病率为75%-100%,死亡率在10%-58%。目前没有特... 详细信息

羊痘病毒粒子大小约为150 Kbp,分子量约为73-91 MDa。该病毒能引起羊的急性、热性、接触性传染病,因其病毒结构及其发病症状和人类的天花很像,又称“羊天花”。根据分离的毒株不同,羊群的发病率为75%-100%,死亡率在10%-58%。目前没有特效治疗药,只有通过实验室诊断和免疫预防来减少疾病的发生。

关键词：疫苗研究羊天花病毒结构实验室诊断山羊痘病毒绵羊痘病毒免疫预防特效治疗血清学诊断方法接触性传染病

小尾寒羊β2微球蛋白的表达及其二级结构预测分析

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中国畜牧兽医 2020年第7期47卷 1990-1996页

作者：王战红赵志荀吴国华朱学亮黄彩云祁斌亮赵芳燕张志东张强中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046

为研究小尾寒羊绵羊白细胞抗原Ⅰ(Ovis aries leukocyte antigen classⅠ,OLAⅠ)轻链四聚体前体链β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)的结构和功能,根据GenBank中公布的绵羊β2m基因设计特异性引物,提取小尾寒羊全血中的RNA并运用RT-... 详细信息

为研究小尾寒羊绵羊白细胞抗原Ⅰ(Ovis aries leukocyte antigen classⅠ,OLAⅠ)轻链四聚体前体链β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)的结构和功能,根据GenBank中公布的绵羊β2m基因设计特异性引物,提取小尾寒羊全血中的RNA并运用RT-PCR方法扩增绵羊β2m基因,将扩增的绵羊β2m基因克隆到pMD18-T载体,筛选出阳性克隆菌pMD18T-OLAⅠ-β2m,经双酶切后与表达载体pET-28a(+)连接,再转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中构建pET-28a(+)-OLAⅠ-β2m重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况;运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β2m蛋白的二级结构。PCR扩增结果显示,目的基因大小为357 bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆到pMD18-T载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株pMD18-T-OLAⅠ-β2m,插入的目的片段大小为357 bp。阳性克隆菌株与表达载体pET-28a(+)经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后获得pET-28a(+)-OLAⅠ-β2m重组表达菌,经IPTG诱导表达,Western blotting检测目的蛋白大小为17.3 ku,目的蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,经洗涤、变性、纯化、初步获得SDS-PAGE纯化的OLAⅠ-β2m蛋白;PORTER在线软件预测OLAⅠ-β2m蛋白的二级结构元件α-螺旋(Hh)、β-折叠(Ee)和无规则卷曲(Cc)分别占22.03%、22.03%和55.93%。本研究成功构建了小尾寒羊β2m基因的pET-28a(+)重组表达体系,运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β2m的二级结构,为下一步绵羊OLAⅠ类分子四聚体的构建奠定基础。

关键词： β2微球蛋白小尾寒羊主要组织相容性复合体包涵体

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同源重组介导的重组病毒研究进展

江苏农业科学 2016年第11期44卷 1-6页

作者：赵银龙李健朱海霞颜新敏赵志荀吴健张强穆晓峰吴国华中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 西北民族大学甘肃兰州730124 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118

病毒同源重组是以同源臂为基础的将目的基因整合到病毒基因组中的技术。将表达盒串联到转移载体,通过同源重组构建重组病毒从而实现病毒基因改造、外源基因表达以及重组活载体疫苗制备等。就重组病毒的优缺点、构建原理及应用进展进行... 详细信息

病毒同源重组是以同源臂为基础的将目的基因整合到病毒基因组中的技术。将表达盒串联到转移载体,通过同源重组构建重组病毒从而实现病毒基因改造、外源基因表达以及重组活载体疫苗制备等。就重组病毒的优缺点、构建原理及应用进展进行了概述,对重组病毒构建的难点进行了分析,全面系统地阐述了重组病毒的构建模式,针对基因框(启动子-报告基因-目的基因-调控元件-终止子)给出具体的构建方案,同时对其未来发展前景进行了展望,以期为今后重组病毒的构建提供理论基础。

关键词：同源重组表达盒转移载体重组病毒病毒载体