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目的:本研究通过人骨髓间充质干细胞(Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,h BMSCs)来源的外泌体(Extracellular Vesicles,EVs)来改变临床骨科最常用的钛支架表面性能,以调节炎症因子的表达和促进成骨的能力。方法:(1)提取、鉴定E... 详细信息

目的:本研究通过人骨髓间充质干细胞(Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,h BMSCs)来源的外泌体(Extracellular Vesicles,EVs)来改变临床骨科最常用的钛支架表面性能,以调节炎症因子的表达和促进成骨的能力。方法:(1)提取、鉴定EVs:分别从培养1 d h BMSCs和向成骨分化3 d的h BMSCs中采用分离试剂盒法分离出两种不同纳米粒径大小的EVs,即1d-EVs和3d-EVs使用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)、纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)、透射电镜对所提取的外泌体进行鉴定。(2)构建钛支架:钛片通过阳极氧化法制备二氧化钛纳米管(Titania Nanotubes,TNT)支架,通过多巴胺涂层、水凝胶涂层将EVs固定于TNT上,构建出四种EVs/TNT:(a)TNT对照组;(b)1d-EVs/TNT组;(c)3d-EVs/TNT组;(d)1d-EVs+3d-EVs/TNT组。(3)四组支架分别接种RAW264.7细胞细胞和h BMSCs,采用q RT-PCR、ELISA、Transwell、电镜观察、免疫组化等方法验证EVs复合钛支架对炎症调控能力与促进成骨能力。结果:(1)从h BMSCs中提取到EVs,通过透射电子显微镜(TEM)观察到外EVs直径峰值集中在30-150 nm之间,具有膜结构并且呈杯型,1d-EVs与3d-EVs两者形态无明显差异。NTA检测1d-EVs的粒径范围为(100.8±14.7 nm)略大于3d-EVs的粒径范围为(90.4±4.7 nm)。WB鉴定出外泌体标记蛋白CD63、CD81。提取到的两种EVs表现出了强大的内化作用。(2)阳极氧化法构建出二氧化钛支架,支架表面可见排列有序的直径约100 nm的六边形或五边形结构。(3)巨噬细胞与该EVs/TNT共同培养时,通过MTT检测结果提示1d-EVs+3d-EVs/TNT组无明显细胞毒性;检测巨噬细胞M2标志物CD206阳性,(d)组的i NOS染色荧光信号减弱,巨噬细胞向M2型分化;与对照组相比IL-6及i NOS的表达分别减少了2倍和1.8倍,抑炎因子IL-10的表达明显增加,P<0.05,具有统计学差异。提示其具有调控炎症免疫作用。(4)当h BSMCs与1d-EVs+3d-EVs/TNT组培养时发现:1d-EVs+3d-EVs/TNT组对h BSMCs无明显的细胞毒性作用。通过激光扫描共聚焦电镜观察到1d-EVs+3d-EVs/TNT组对h BSMCs有较强的迁移功能。通过q RT-PCR测定ALP、Col-I、Runx2、OPN等相关成骨基因表达显著增加。结论:(1)通过EVs分离试剂盒成功提取了h BMSCs来源的EVs;(2)成功构建1d-EVs+3d-EVs/TNT,其内层为多巴胺涂层1d-EVs,外层为水凝胶涂层3d-EVs;(3)1d-EVs+3d-EVs/TNT能显著调控巨噬细胞介导的炎症反应,并增强h BMSCs体外的迁移与成骨分化能力,这有望成为一种新型的生物材料促进骨愈合。

关键词：外泌体钛支架骨愈合炎症调控膜诱导组织再生术

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