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2株林麝源肺炎克雷伯氏菌的全基因组序列分析和新基因kp05372的原核表达

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2株林麝源肺炎克雷伯氏菌的全基因组序列分析和新基因kp05372的原...

作者：赵位四川农业大学

学位级别：硕士

林麝作为国家一级保护动物,林麝的人工养殖一直受肺炎制约。在四川某林麝养殖场曾爆发肺炎,死亡率极高。本课题组从死亡林麝肺脏分离出1株肺炎克雷伯氏菌,命名为LPKP。将LPKP与实验室保存的1株林麝肠源肺炎克雷伯氏菌致病菌株GPKP进行... 详细信息

林麝作为国家一级保护动物,林麝的人工养殖一直受肺炎制约。在四川某林麝养殖场曾爆发肺炎,死亡率极高。本课题组从死亡林麝肺脏分离出1株肺炎克雷伯氏菌,命名为LPKP。将LPKP与实验室保存的1株林麝肠源肺炎克雷伯氏菌致病菌株GPKP进行了小鼠致病性和全基因组序列对比分析,并对GPKP基因组中的新基因kp05372进行生物信息学分析和原核表达载体构建。主要研究内容和实验结果如下:1.林麝肺源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及致病性分析结合生化试验和分子生物学鉴定,死亡林麝肺脏分离菌为肺炎克雷伯氏菌,命名为LPKP。将LPKP与另一株实验室保存的林麝肠源肺炎克雷伯氏菌致病菌株GPKP进行小鼠致病性和荚膜分析。两株菌都能够引起小鼠死亡,剖检可见肝脏、肺脏肿大等病理变化。LPKP对小鼠半数致死量(LD50)为4.1×10 CFU/mL,GPKP对小鼠LD50为6.3×107CFU/mL,病理组织切片分析两菌株均能够引起小鼠肺、肝、肾发生病理变化,而GPKP还能够引起小鼠空肠发生病理损伤。印度墨汁染色显示两菌株菌体四周有一层透明的荚膜带。2.两株肺炎克雷伯氏菌的全基因组测序分析全基因组测序分析结果显示,LPKP基因组大小为4,736,259 bp,包含5,516个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),GPKP基因组大小为4,879,707 bp,包含5,490个ORF。进化分析发现,LPKP与K.pneumoniae KP-1同属于一个分支,GPKP与K.pneumoniae YH43同属于一个分支;MLST分析发现,LPKP序列类型为ST29,GPKP序列类型未知;wzi和wzc基因型分型方法不能对GPKP荚膜进行分型,而LPKP荚膜型为K54型;荚膜基因簇结构分析表明,LPKP荚膜基因簇包含20个基因,且同一K54型荚膜基因簇高度保守。而GPKP荚膜基因簇包含24个基因,荚膜相关基因manCB存在于GPKP荚膜基因簇的3’端,这与其它79个已知荚膜基因簇均不相同。该分析结果与PCR扩增结果相符;特有基因分析显示,GPKP基因组中共有840个特有基因,功能分析表明其中有5个基因与细菌的毒力相关,参与编码了RfbU、FbpC、FbpB、FbpA和IrgA等毒力蛋白。3.新基因kp05372原核表达载体构建基于GPKP全基因组序列注释分析,筛选到一个新基因kp05372,上传到Genbank数据库,获得登录号为KX026659。kp05372基因包含909个碱基序列,编码产物由302个氨基酸组成,无信号肽,是一种不稳定的、在细胞内发挥生理作用的脂溶蛋白?其结构域N端为保守的螺旋-转角-螺旋结构(helix-turn-helix,HTH),C端为Lys R底物结合的调控结构域,启动子分析显示其启动子区域具有正反双向启动子和非典型的-10盒和-35盒等特性。生物信息学分析表明KP05372是一个典型的Lys R型转录调控因子(LysR-type transcriptional regulator,LTTR)。将kp05372基因连接原核表达载体p ET-32(a)中,获得重组表达质粒p ET-32(a)/kp05372,转入表达菌株BL21(DE3)中。经SDS-PAGE和Western-blotting分析,最佳表达条件为37℃,0.6 mmol/LIPTG诱导表达6 h,融合蛋白分子量约为53.2 k D。综上所述,本研究成功地从林麝肺脏中分离出一株致病性肺炎克雷伯氏菌LPKP,LPKP对小鼠LD50大于肠道分离株GPKP。GPKP基因组特有的毒力相关基因以及特有的荚膜型可能是导致其特有致病表型的重要原因。同时,新LTTR kp05372的生物信息学分析及原核表达载体构建,为该基因的功能研究奠定了基础。

关键词：林麝肺炎克雷伯氏菌致病性全基因组测序新基因原核表达

微小RNA-483-3p调控细胞自噬减轻大鼠心肌纤维化的机制研究

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中华老年心脑血管病杂志 2024年第6期26卷 683-687页

作者：陈礼琴吕祥威赵位昆覃秋语何梓峰李月嫦卢钰芬桂林医学院附属医院综合科 541001 桂林医学院发展规划和医院管理处

目的研究微小RNA(miR)-483-3p减轻大鼠心肌纤维化的作用,探讨其机制与细胞自噬的关系。方法选取24只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、空白转染组和高表达组,每组6只,通过尾静脉注射异丙肾上腺素建立心肌纤维化模型。空白转染组及... 详细信息

目的研究微小RNA(miR)-483-3p减轻大鼠心肌纤维化的作用,探讨其机制与细胞自噬的关系。方法选取24只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、空白转染组和高表达组,每组6只,通过尾静脉注射异丙肾上腺素建立心肌纤维化模型。空白转染组及高表达组通过尾静脉分别单次注射腺相关病毒(AAV)-空白转染、AAV-miR-483-3p(5×10^(11)vg)进行预处理。14 d后,假手术组经尾静脉注射0.9%的氯化钠溶液[2.5 ml/(kg·d)],持续14 d;模型组、空白转染组和高表达组通过尾静脉注射异丙肾上腺素[2.5 ml/(kg·d),2 mg/ml],持续14 d。检测大鼠心肌病理损伤程度、心肌纤维化程度、胶原蛋白Ⅰ(Collagen-Ⅰ)表达量以及心肌细胞中微管相关蛋白轻链3(LC3)、细胞自噬相关蛋白5(Atg5)和自噬降解底物(P62)的表达。结果与假手术组比较,模型组心肌纤维化面积、Collagen-Ⅰ阳性表达量、Atg5及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著增加,P62蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,高表达组心肌纤维化面积、Collagen-Ⅰ阳性表达量、Atg5及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低[(13.64±1.51)%vs(27.47±1.55)%,(13.48±3.07)%vs(30.91±2.45)%,0.98±0.17 vs 1.24±0.28,0.66±0.05 vs 1.26±0.09,P<0.05],P62蛋白表达水平显著增高(0.91±0.11 vs 0.74±0.06,P<0.05)。结论miR-483-3p可减轻大鼠心肌纤维化,其机制可能与抑制心肌细胞自噬有关。

关键词：自噬肌细胞心脏心肌纤维化微小RNA-483-3p

林麝肺源致病性大肠杆菌O78株crl毒力基因缺失株的构建及其生物学特性研究

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中国预防兽医学报 2016年第12期38卷 953-958页

作者：田青周鑫罗燕程建国赵位四川农业大学动物医学院四川温江625014 四川农业大学微生物学实验室四川都江堰611830 四川养麝研究所四川都江堰611830

大肠杆菌Crl和Rpo S蛋白的相互作用能够直接促进curli菌毛操纵子的表达,curli菌毛对宿主细胞的黏附性及侵袭性密切相关。为研究林麝肺源致病性大肠杆菌(LPEC)O78株crl毒力基因缺失对其生物学特性和毒力特性的影响,本研究采用λ-Red同源... 详细信息

大肠杆菌Crl和Rpo S蛋白的相互作用能够直接促进curli菌毛操纵子的表达,curli菌毛对宿主细胞的黏附性及侵袭性密切相关。为研究林麝肺源致病性大肠杆菌(LPEC)O78株crl毒力基因缺失对其生物学特性和毒力特性的影响,本研究采用λ-Red同源重组的方法构建了林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株LPEC O78-crl-,并通过生化特性、生长速率、红细胞凝集性、毒力特性对缺失株进行鉴定。结果表明,与野生株LPEC O78相比较,LPEC O78-crl-对林麝LPEC O78的生化特性和生长速率影响差异不显著;LPEC O78-crl-的红细胞凝集效价为2^(-4),比LPEC O78降低了2倍,其LD50为3.2×10~9 cfu/m L,与野生株LPEC O78相比下降约7倍。本研究构建了林麝LPEC O78-crl-,为进一步研究林麝LPEC的致病机理奠定基础。

关键词：林麝肺源致病性大肠杆菌 crl基因 λ-Red同源重组

两株GI.1型和GI.2型兔出血症病毒RdRp基因的克隆与分析

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浙江农业学报 2023年第6期35卷 1286-1296页

作者：庞雪晴唐诗曾红梅赵位王印罗燕姚学萍任梅渗任永军杨泽晓四川农业大学动物医学院四川成都611130 四川省畜牧科学研究院四川成都610066

为了解兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)RdRp基因的遗传稳定性和变异规律,本研究分别克隆了RHDV SCH04株和RHDV2 SCCN03株的RdRp基因,然后对基因序列进行比对和系统发育分析,并通过编码蛋白质的理化性质、信号肽、... 详细信息

为了解兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)RdRp基因的遗传稳定性和变异规律,本研究分别克隆了RHDV SCH04株和RHDV2 SCCN03株的RdRp基因,然后对基因序列进行比对和系统发育分析,并通过编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜区域、二级结构、三级结构、磷酸化和糖基化修饰位点的预测,对RdRp进行生物信息学分析。结果显示,两株RdRp基因序列全长均为1548 bp,编码516个氨基酸。GI.1型RHDV毒株间序列相似性为86.9%~99.9%,GI.2型RHDV毒株间为91.3%~99.9%。GI.1型和GI.2型RHDV毒株间序列相似性为84.3%~88.3%。SCH04株和SCCN03株分别属于GI.1a型和GI.2型RHDV,且SCH04株和SCCN03株的RdRp基因核苷酸序列相似性为84.95%,其编码蛋白存在17个氨基酸差异位点,氨基酸序列相似性为96.71%;二者均属于稳定蛋白,不存在信号肽和跨膜区域;其分子量、等电点、脂溶系数、平均亲水系数和不稳定系数等指标无显著差异。SCH04株RdRp的α螺旋和β转角比例比SCCN03株略高,分别为41.86%和4.26%,而SCCN03株RdRp的延伸链和无规则卷曲比例比SCH04株略高,分别为12.79%和43.41%;SCCN03株RdRp比SCH04株多4个磷酸化位点和1个N-糖基化位点。分析结果表明不同型间RHDV RdRp基因核苷酸变异率较高,GI.1 RHDV毒株间的变异范围大于GI.2 RHDV毒株。SCH04株和SCCN03株RHDV RdRp的氨基酸序列相似性高于核苷酸序列相似性,其二级结构和高级结构差异较小,遗传相对稳定。本研究为RHDV的遗传演变和生物合成等分子病原学研究提供了科学参考。

关键词：兔出血症病毒 RdRp 对比分析生物信息学分析

林麝肺成纤维细胞线粒体全基因组结构特征及遗传变异分析

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西北农业学报 2023年第4期32卷 534-541页

作者：唐可欣伍茜付文龙程建国吴杰周磊王翔赵位任梓薇李依濛刘洁罗燕四川农业大学动物医学院成都611130 四川养麝研究所四川都江堰611800

林麝(Moschus berezovskii)是一种具有较高经济价值和药用价值的保护野生动物。为深入研究林麝线粒体基因组的结构特征及遗传变异,基于IlluminaNovaSeq平台对林麝肺成纤维细胞FMD-C1线粒体进行全基因组测序,并进行特征注释、结构预测、... 详细信息

林麝(Moschus berezovskii)是一种具有较高经济价值和药用价值的保护野生动物。为深入研究林麝线粒体基因组的结构特征及遗传变异,基于IlluminaNovaSeq平台对林麝肺成纤维细胞FMD-C1线粒体进行全基因组测序,并进行特征注释、结构预测、序列分析和系统发育重建。结果显示,FMD-C1线粒体基因组序列全长为16351bp,共有13个蛋白编码基因(protein coding gene,PCG),22个tRNA,2个rRNA和两段非编码区,具有明显的AT偏好性。将序列上传至GenBank,登录号为MW879208。与NCBI上林麝的其余序列比对,FMD-C1的4个PCGs中检测出5个单氨基酸突变和3个插入氨基酸;D-loop区检测出19个差异碱基和2个碱基缺失。系统进化分析发现与林麝亲缘关系最近的是安徽麝。研究结果可为林麝的选育和遗传多样性保护提供参考依据,也为进一步探讨林麝肺部疾病线粒体水平的致病机制奠定基础。

关键词：林麝线粒体基因组蛋白编码基因非编码区系统进化

林麝肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及其kp05372基因的生物信息学分析

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2017年第12期45卷 23-30页

作者：赵位王吴优程建国田青罗燕四川农业大学动物医学院四川温江625014 四川养麝研究所四川都江堰611830

【目的】对1株疑似肺炎克雷伯氏菌进行分离鉴定及全基因测序分析,并对发现的新基因kp05372编码产物进行生物信息学分析。【方法】采用传统的细菌鉴定方法和分子生物学方法,分别对采自麝粪便的1株病原菌的生理生化特征及16SrRNA序列进行... 详细信息

【目的】对1株疑似肺炎克雷伯氏菌进行分离鉴定及全基因测序分析,并对发现的新基因kp05372编码产物进行生物信息学分析。【方法】采用传统的细菌鉴定方法和分子生物学方法,分别对采自麝粪便的1株病原菌的生理生化特征及16SrRNA序列进行测定;以小鼠感染试验和半数致死量(LD50)测试该病原菌的致病性;用全基因组测序方法对病原菌基因组进行测序分析,并对发现的新基因编码产物进行生物信息学分析。【结果】经生理生化试验和16SrRNA序列分析发现,分离菌株为肺炎克雷伯氏菌,命名为GPKP,其对小鼠致死的LD50为6.3×107CFU/mL。该菌基因组大小为4 879 707bp,包含5 490个开放阅读框,共注释到22组COG功能。kp05372基因编码产物由302个氨基酸组成,无信号肽,是一种不稳定的、在细胞内发挥生理作用的亲水性蛋白。【结论】分离的细菌为肺炎克雷伯氏菌,kp05372基因编码产物属于典型的LysR家族转录因子(LTTR)。

关键词：林麝肺炎克雷伯氏菌 kp05372 生物信息学分析

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儿科优质护理中支气管肺炎临床路径的应用

基层医学论坛 2014年第21期18卷 2837-2838页

作者：赵位张家界市中医院湖南张家界427000

目的探讨儿科优质护理中支气管肺炎临床路径的应用效果。方法抽取我院120例支气管肺炎患儿,随机分为观察组与对照组。给予对照组患儿常规护理措施,给予观察组患儿支气管肺炎临床路径护理模式。对2组患儿护理效果进行比较。结果观察组护... 详细信息

目的探讨儿科优质护理中支气管肺炎临床路径的应用效果。方法抽取我院120例支气管肺炎患儿,随机分为观察组与对照组。给予对照组患儿常规护理措施,给予观察组患儿支气管肺炎临床路径护理模式。对2组患儿护理效果进行比较。结果观察组护理人员接瓶次数、记录时间均低于对照组。对照组患儿家属满意度为33.33%,观察组患儿家属满意度为81.67%,观察组显著高于对照组。结论儿科优质护理中支气管肺炎临床路径的应用,可有效提高患儿家属对护理服务质量的满意度,值得临床推广。

关键词：儿科优质护理支气管肺炎临床路径

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林麝粪便基因组DNA的提取及PCR扩增

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2016年第11期44卷 1-7页

作者：康强周鑫罗燕田青程建国赵位四川农业大学森林资源保护与利用实验室四川都江堰611830 四川农业大学微生物学实验室四川都江堰611830 四川农业大学动物医学院四川都江堰611830 四川养麝研究所四川都江堰611830

【目的】探索从林麝粪便中提取基因组DNA并进行物种鉴定的可行性,为林麝野外调查工作以及分子粪便学在林麝保护中的应用提供科学依据。【方法】采集林麝粪便,采用改良的CTAB抽提基因组DNA;按常规PCR法对mtDNA D-loop区和Cyt b基因进行... 详细信息

【目的】探索从林麝粪便中提取基因组DNA并进行物种鉴定的可行性,为林麝野外调查工作以及分子粪便学在林麝保护中的应用提供科学依据。【方法】采集林麝粪便,采用改良的CTAB抽提基因组DNA;按常规PCR法对mtDNA D-loop区和Cyt b基因进行扩增测序后,用DNAMAN 6.0软件进行系统发育分析;在不同温度存放不同时间,研究林麝粪便基因组DNA的提取与mtDNA D-loop区和Cyt b基因PCR扩增的时效性。【结果】以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增均能特异性地扩增出mtDNA D-loop区和Cyt b基因。系统发育分析结果表明:所扩增产物为林麝的mtDNA D-loop区和Cyt b基因。时效性分析结果显示:常温和4℃条件下保存96h以内的林麝粪便所提取的基因组DNA能有效扩增出mtDNA D-loop区和Cyt b基因。【结论】自然条件下林麝粪便中林麝自身体细胞DNA保存时间较长,通过在野外采集林麝粪便提取基因组DNA并进行物种鉴定是可行的。

关键词：林麝粪便线粒体DNA D-loop区 Cyt b基因

林麝肺源致病性大肠杆菌感染BALB/c小鼠模型的建立及评价

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微生物学通报 2018年第6期45卷 1333-1341页

作者：王吴优田青程建国赵位邓磊罗燕四川农业大学动物医学院四川温江611130 四川养麝研究所四川都江堰611830

【背景】林麝肺源致病性大肠杆菌(Lung pathogenic Escherichia coli,LPEC)属于肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,Ex PEC),是重要的人畜共患病病原菌之一。【目的】建立林麝肺源致病性大肠杆菌感染BALB/c小鼠模型,为研究林麝LPEC O78的致病性提供实验基础。【方法】采用实验室保存的林麝LPEC优势血清型O78菌株腹腔注射BALB/c小鼠,计算LD50,确定造模感染剂量,通过监测感染后体重、生化指标、器官中细菌定殖量变化,以及进行细菌分离鉴定和组织病理学检查,评价造模效果。【结果】确定了LPEC O78致BALB/c小鼠的LD50为3.6×108 CFU/m L。实验组小鼠于攻毒后3 h出现精神萎靡、食欲不振、反应迟钝,剖检见肺脏及肝脏肿大、小肠出血。24 h内体重下降3.2 g左右,随后缓慢升高。生化指标中除尿酸含量与对照组不显著(P>0.05)外,谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白、磷、钙、镁、总胆红素、尿素、血糖、胆碱酯酶和乳酸脱氢酶等指标均高于对照组水平,且组间变化显著(P<0.05)。各器官均有细菌定殖,心、脾及肾脏24 h达到最高,肝、肺及肠道12 h达到最高,之后随时间逐渐减少。小鼠各器官有不同程度的炎性细胞浸润和细胞坏死。【结论】成功建立了林麝LPEC O78感染BALB/c小鼠模型,为林麝LPEC O78的发病机制、病理生理等方面的研究奠定了一定基础。

关键词：林麝肺源致病性大肠杆菌 BALB/c小鼠感染模型