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中药单体靛玉红抗LPS诱导的小鼠乳腺炎作用及机制研究

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中药单体靛玉红抗LPS诱导的小鼠乳腺炎作用及机制研究

作者：赖金伦华中农业大学

学位级别：硕士

奶牛乳腺炎是奶牛常见病和多发病,是奶牛场危害大、投入多、难防治的疾病,正制约着我国乃至全球奶牛业的发展。绝大部分奶牛乳腺炎由病原微生物粘附乳腺组织引起,迄今分离鉴定可导致奶牛发生乳腺炎的病原微生物达130多种,其中金黄色葡... 详细信息

奶牛乳腺炎是奶牛常见病和多发病,是奶牛场危害大、投入多、难防治的疾病,正制约着我国乃至全球奶牛业的发展。绝大部分奶牛乳腺炎由病原微生物粘附乳腺组织引起,迄今分离鉴定可导致奶牛发生乳腺炎的病原微生物达130多种,其中金黄色葡萄球菌、链球菌及大肠杆菌占80%以上。尽管世界各国学者已对奶牛乳腺炎防治开展了近100余年的不懈研究,至今仍未提出一个可有效防治奶牛乳腺炎的方法。抗生素疗法一直作为防治奶牛乳腺炎的首选方法,伴随其长期大量使用甚至滥用,病原耐药性乃至多重耐药性愈发普遍,逐渐成为制约乳腺炎防治的瓶颈。食源性的动物病原甚至可借助相关食物链和耐药质粒将耐药性传递给人类,给人类疾病防治带来前所未有的挑战和困扰。中草药作为纯天然草药,含多种复杂有效的生物活性成分,具有作用广泛、不会或者难产生耐药性、低毒、无或低残留等优势,兼具药物和营养剂的双重功效,日益受到国内外专家学者的青睐。靛玉红是从中药青黛中分离出的吲哚类化合物,是青黛、大青叶、板蓝根等中药发挥效应的重要成分之一,具有抗肿瘤、抑菌消炎、神经保护、抗病毒和抗寄生虫等方面作用,具有抗生素无法比拟的优势,且在防治奶牛乳腺炎、实现绿色养殖和生产无药物残留动物制品上具有非常好的潜力。因此我们提出了靛玉红具有抗乳腺炎作用的科学设想。本课题从分子、细胞和机体三个不同层次研究靛玉红对LPS诱导的小鼠乳腺炎的防治作用并初步阐明其作用机制,为靛玉红防控奶牛乳腺炎奠定理论及实践基础。主要研究结果如下:1.小鼠乳腺上皮细胞的提取及鉴定妊娠15-20天小鼠乳腺组织采用胰蛋白酶和胶原酶混合消化法提取小鼠乳腺上皮细胞(MMECs),提取的MMECs呈圆形、椭圆或橄榄状生长,在铺板的12小时基本贴壁,48小时长满T75细胞瓶,长满细胞瓶后呈铺路石状、鹅卵石状紧密生长。免疫荧光检测到MMECs细胞质中标记上角蛋白-18的单一明亮的绿色荧光信号,且细胞生长情况良好,纯度较好。2.靛玉红和LPS试验浓度的确定使用不同脂多糖诱导MMECs,24h后收集样品,qRT-PCR检测IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子mRNA表达水平,确定脂多糖诱导MMECs产生炎症反应的最佳浓度。结果显示,随着LPS诱导浓度的升高,三种炎性因子的表达水平都不断上升,在终浓度为1μg/m L时均显著升高(p<0.001),并在浓度为0.8-1μg/mL时比1-2μg/mL表达水平上升趋势明显,因此后续试验均选择终浓度为1μg/m L的LPS为诱导浓度。MTT试验检测1-1000nM靛玉红对MMECs活性的影响。结果证明,低浓度的靛玉红(1-250nM)对MMECs活性几乎没有影响,并且与LPS和靛玉红诱导顺序关系不大;250nM以上浓度靛玉红对MMECs存在明显的毒性作用。另用qRT-PCR检测证明25nM以上浓度靛玉红对IL-1β、IL-6和TNF-α具有明显抑制作用(p<0.001)。因此后期试验选择25、50和100nM三个浓度靛玉红孵育MMECs,研究靛玉红对MMECs炎症的防治效果,对于动物试验则相应提高1000倍作为试验浓度。3.靛玉红治疗LPS诱导MMECs炎症和小鼠乳腺炎作用及机制研究纯化后的MMECs培养至细胞培养板80%左右,使用LPS诱导MMECs产生炎症作用,1h后使用靛玉红共孵育24h。ELISA和qRT-PCR检测IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。试验表明,相对于LPS组,靛玉红组中三个促炎因子表达水平都随靛玉红浓度的上升不断下降,并在100nM处显著降低(p<0.001)。Western bolt和qRT-PCR检测靛玉红对COX-2活性的影响。试验表明,靛玉红可以剂量依赖性地抑制LPS诱导引起的COX-2活性的增加。从而证明靛玉红可以抑制LPS诱导MMECs的炎症反应。产后5-7d昆明鼠,乳腺灌注LPS建立小鼠乳腺炎模型,对照组乳腺灌注PBS,并在1h和12h分别腹腔注射PBS、0.1%DMSO和靛玉红观察其对小鼠乳腺炎的影响。乳腺组织大体组织及病理学观察,对照组小鼠乳腺没有观察到病理变化;LPS组小鼠乳腺相对于对照组,出现水肿、潮红、变性甚至局部坏死、大量乳汁蓄积,乳腺腺泡壁增厚、大量的中性粒细胞浸润等变化,综合评分较对照组显著升高(p<0.001);靛玉红可以改善LPS诱导小鼠乳腺的炎症症状,伴随靛玉红使用剂量增加效果更明显,评分不断下降。ELISA检测靛玉红对小鼠乳腺组织和血清中MPO、IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平的影响。结果证明靛玉红可以剂量依赖性的抑制LPS诱导乳腺炎小鼠中MPO活性和三种促炎因子的表达,对小鼠乳腺炎具有很好的治疗效果。靛玉红抑制脂多糖诱导小鼠乳腺炎的机制是什么,是否与脂多糖引起炎症作用的通路存在相关性呢?我们首先检测了靛玉红对TLR4信号通路的影响。试验证明靛玉红可以剂量依赖性抑制TLR4的表达,发挥对LPS诱导的MMECs炎症和小鼠乳腺炎的治疗作用

关键词：靛玉红脂多糖乳腺炎炎症防治机制凋亡

靛玉红抑制脂多糖诱导小鼠乳腺上皮细胞凋亡的研究

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中国兽医科学 2020年第12期50卷 1587-1593页

作者：赖金伦郭爱珍胡长敏华中农业大学动物医学院湖北武汉430070 茂名市农业科技推广中心广东茂名525000

奶牛乳腺炎是严重危害养牛业的重要疾病,仍缺乏有效治疗手段。乳腺上皮细胞作为乳腺的第一道防线,其适时凋亡在奶牛乳腺炎转归中发挥着关键作用。中药单体靛玉红作用广泛,兼具难耐药、低毒、无残留等优点,为奶牛乳腺炎绿色高效防治提供... 详细信息

奶牛乳腺炎是严重危害养牛业的重要疾病,仍缺乏有效治疗手段。乳腺上皮细胞作为乳腺的第一道防线,其适时凋亡在奶牛乳腺炎转归中发挥着关键作用。中药单体靛玉红作用广泛,兼具难耐药、低毒、无残留等优点,为奶牛乳腺炎绿色高效防治提供了新思路。本研究旨在探讨靛玉红对脂多糖诱导的小鼠乳腺上皮细胞凋亡的影响并阐明机制。通过使用脂多糖刺激小鼠乳腺上皮细胞建立凋亡模型,并设置空白对照组、二甲基亚砜组及脂多糖组三个对照组,使用不同浓度的靛玉红,在脂多糖诱导前和诱导后实施干预,从凋亡细胞形态、凋亡相关基因m RNA和蛋白水平,观察靛玉红对脂多糖诱导小鼠乳腺上皮细胞凋亡的影响。结果,靛玉红可以剂量依赖性改善脂多糖诱导小鼠乳腺上皮细胞发生的凋亡现象,显著促进脂多糖诱导小鼠乳腺上皮细胞中Bcl-x L、Bcl-2等抗凋亡基因表达,抑制Bak、Bax、Caspase-8和Caspase-3等促凋亡基因和蛋白表达有关。上述结果表明,靛玉红通过促进抗凋亡基因的表达及抑制促凋亡基因表达,适时调控脂多糖诱导的小鼠乳腺上皮细胞凋亡。

关键词：靛玉红小鼠乳腺上皮细胞脂多糖乳腺炎凋亡

SIGIRR对奶牛乳腺上皮细胞TLR4致炎信号通路的负调控作用

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中国兽医学报 2018年第2期38卷 404-410页

作者：周秋格刘畅赖金伦郭爱珍胡长敏华中农业大学动物医学院湖北武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉450070

旨在探究SIGIRR对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）TLR4信号通路的负调控作用。构建SIGIRR—pEGFP真核表达载体，脂质体法转染HEK293T及BMECs，荧光显微镜观察及Westernblot验证融合蛋白SIGIRR—pEGFP的表达；LPS刺激转染后BMECs，检测TLR4及... 详细信息

旨在探究SIGIRR对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）TLR4信号通路的负调控作用。构建SIGIRR—pEGFP真核表达载体，脂质体法转染HEK293T及BMECs，荧光显微镜观察及Westernblot验证融合蛋白SIGIRR—pEGFP的表达；LPS刺激转染后BMECs，检测TLR4及其信号通路分子IRAK1、IRAK4和TRAF6的变化，以及下游炎性因子IL-6、IL-8、IL-18和TNF-a的表达量。结果显示，成功构建SIGIRR-pEGFP真核表达载体，荧光检测重组质粒转染到HEK293T和BMECs中；Westernblot鉴定融合蛋白SIGIRR—pEGFP表达正确；重组质粒转染BMECs后，SIGIRR表达量较转染空载质粒组及空白未转染组显著升高（P〈0．01）；炎性因子IL-6、IL-8、IL-10、TNFa、TLR4及下游信号分子IRAK1、IRAK4、TRAF6表达量显著降低（P〈0．01），转染空载质粒组与空白未转染组相比仅IRAKl表达量有差异（P〈0．05）。结果表明，本试验通过研究牛SIGIRR在BMECs中的作用，证实sIGIRR基因具有炎性负调控LPS-TLR4信号通路的作用，具有潜力成为临床治疗奶牛乳腺炎的新靶标。

关键词：奶牛乳腺炎乳腺上皮细胞 SIGIRR TLR4信号通路负性调控

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克氏针在犬骨折外固定支架术中的应用效果

养殖与饲料 2020年第4期19卷 27-32页

作者：赖金伦邓健彬周庆国广东省茂名市农业科技推广中心广东茂名525000 佛山科学技术学院生命科学学院广东佛山528000 华中农业大学动物医学院武汉430070

选择4只3~5月龄、3~7 kg杂交犬,随机分为A、B两组,对A、B两组犬分别制作前肢桡骨和后肢胫骨骨折模型,再用克氏针组合成外固定支架进行固定,以期了解外固定支架运用于犬骨折手术的操作技巧、术后护理要点及骨折愈合时间,同时探索克氏针... 详细信息

选择4只3~5月龄、3~7 kg杂交犬,随机分为A、B两组,对A、B两组犬分别制作前肢桡骨和后肢胫骨骨折模型,再用克氏针组合成外固定支架进行固定,以期了解外固定支架运用于犬骨折手术的操作技巧、术后护理要点及骨折愈合时间,同时探索克氏针在骨折外固定支架术中的应用效果。试验结果显示,术部炎症常见,针道感染普遍,针道感染易造成克氏针松脱,以A组的克氏针较B组容易脱出。在针道口涂抹红霉素软膏或太白老翁散可有效抑菌和制止渗出,术肢于术后3 d即点地行走,7~8周骨折线模糊。因此,骨折外固定支架术操作简单,骨折愈合时间短,易出现术部和针道感染,克氏针在外固定支架术中的应用效果一般,后肢应用效果较前肢稳定。

关键词：犬骨折克氏针外固定支架术

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一例猪链球菌病的防控案例分析

兽医导刊 2020年第2期 64-65页

作者：潘尚福赖金伦茂名市畜牧技术推广站广东茂名525100

猪链球菌病是由致病性链球菌引起的人畜共患病,猪以败血症、脑膜炎、关节炎、肺炎和淋巴结脓肿为主要临床表现.本文从某猪场疑似猪链球菌病猪中采集5份样品,通过细菌分离鉴定、病毒检测,并进行药物敏感性试验,最终鉴定分离菌为猪链球菌... 详细信息

猪链球菌病是由致病性链球菌引起的人畜共患病,猪以败血症、脑膜炎、关节炎、肺炎和淋巴结脓肿为主要临床表现.本文从某猪场疑似猪链球菌病猪中采集5份样品,通过细菌分离鉴定、病毒检测,并进行药物敏感性试验,最终鉴定分离菌为猪链球菌,并确定敏感药物,科学治疗后有效控制了病情.

关键词：猪链球菌分离鉴定防控分析

中药防治奶牛乳腺炎的临床应用及作用机制研究进展

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中国兽医学报 2017年第2期37卷 381-385页

作者：赖金伦刘玉辉陈颖钰胡长敏郭爱珍华中农业大学动物医学院湖北武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 华中农业大学国家肉牛产业技术体系疾病控制功能研究室湖北武汉430070

中药是我国传统医学的瑰宝,生物成分多样,疗效确切,已广泛用于奶牛乳腺炎的临床防治。现就中药防治奶牛乳腺炎的临床应用,以及中药抑制病原微生物、降低乳腺炎症反应、阻断乳腺细胞炎性信号通路、促进乳腺上皮细胞增殖和增强奶牛机体免... 详细信息

中药是我国传统医学的瑰宝,生物成分多样,疗效确切,已广泛用于奶牛乳腺炎的临床防治。现就中药防治奶牛乳腺炎的临床应用,以及中药抑制病原微生物、降低乳腺炎症反应、阻断乳腺细胞炎性信号通路、促进乳腺上皮细胞增殖和增强奶牛机体免疫力的作用机理做一综述。

关键词：中药奶牛乳腺炎临床应用作用机理

犊牛支原体肺炎继发牛A型多杀性巴氏杆菌感染的诊治

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中国畜牧兽医 2015年第11期42卷 3065-3072页

作者：赖金伦寇明明刘玉辉朱习芳刘婧姜鹏陈颖钰胡长敏郭爱珍华中农业大学动物医学院武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

某奶牛场犊牛相继发生肺炎和关节炎,为确诊该牛场犊牛群发病的原因并提出防控方案,本试验剖检新生犊牛并采集病料,分别开展牛支原体及其他病原菌的分离培养、PCR鉴定及药敏分析;进行牛病毒性腹泻病毒、牛口蹄疫病毒和牛传染性鼻气管炎病... 详细信息

某奶牛场犊牛相继发生肺炎和关节炎,为确诊该牛场犊牛群发病的原因并提出防控方案,本试验剖检新生犊牛并采集病料,分别开展牛支原体及其他病原菌的分离培养、PCR鉴定及药敏分析;进行牛病毒性腹泻病毒、牛口蹄疫病毒和牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测;制作犊牛肺脏组织病理切片并进行观察和评估。从犊牛肺脏组织分离到牛支原体和牛A型多杀性巴氏杆菌;牛病毒性腹泻病毒、牛口蹄疫病毒和牛传染性鼻气管炎病毒检测均为阴性;肺脏组织病理切片可见肺泡结构破坏、出血及大量炎性细胞浸润;药敏试验结果显示,牛支原体和牛A型多杀性巴氏杆菌分别对泰乐菌素和头孢唑啉敏感,但对青霉素、庆大霉素、林可霉素和氨苄西林均呈现耐药。该犊牛群确诊为牛支原体肺炎继发牛A型多杀性巴氏杆菌感染,采用泰乐菌素联合头孢唑啉肌肉注射,配合对症治疗和规范管理,有效控制了该场犊牛疾病。

关键词：犊牛牛支原体肺炎牛A型多杀性巴氏杆菌诊断治疗

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牛支原体膜蛋白的研究进展

中国兽医学报 2018年第10期38卷 2011-2014,2019页

作者：刘畅曹钰晗赵春阳徐璐尧张文劲唐鑫赖金伦陈颖钰郭爱珍胡长敏华中农业大学动物医学院湖北武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

支原体（Mvfoplasma）是目前世界上最小的、进行自我复制的、且能在无生命培养基中生长的原核生物，结构简单．缺乏细胞壁。能通过0．22微米的细菌滤器。支原体种类繁多，对人类和动植物造成的危害大，且易污染体外培养的细胞，给科研... 详细信息

支原体（Mvfoplasma）是目前世界上最小的、进行自我复制的、且能在无生命培养基中生长的原核生物，结构简单．缺乏细胞壁。能通过0．22微米的细菌滤器。支原体种类繁多，对人类和动植物造成的危害大，且易污染体外培养的细胞，给科研工作带来多重不利影响。

关键词：牛支原体膜蛋白结构功能应用

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鹿结核病的流行及防控进展

中国兽医学报 2018年第2期38卷 428-432页

作者：葛盼王洁茹王杰赖金伦陈颖钰郭爱珍华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 华中农业大学动物科技学院湖北武汉430070 华中农业大学动物医学院湖北武汉480070 湖北省兽医流行病学国际科技合作基地湖北武汉430070

鹿结核病是由牛分枝杆菌引起的鹿的慢性、消耗性传染病，广泛流行于世界各地，严重危害着养鹿业的发展，同时也威胁着人类健康和其他动物的安全。为保证养鹿业的发展和人类的健康，对该病进行有效防控显得十分重要。美国、新西兰等国家... 详细信息

鹿结核病是由牛分枝杆菌引起的鹿的慢性、消耗性传染病，广泛流行于世界各地，严重危害着养鹿业的发展，同时也威胁着人类健康和其他动物的安全。为保证养鹿业的发展和人类的健康，对该病进行有效防控显得十分重要。美国、新西兰等国家通过对可疑感染的鹿群进行持续性监测和利用捕猎季节减少感染鹿群的数量等策略，成功实现了对鹿结核的控制。现对国内外鹿结核病的流行现状、诊断技术及疫苗研究进行综述，以期为鹿结核病的防控提供借鉴。

关键词：鹿结核病牛分枝杆菌防控