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TfR亲和肽-阿霉素偶联物的制备与体外靶向抗肿瘤活性研究

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TfR亲和肽-阿霉素偶联物的制备与体外靶向抗肿瘤活性研究

作者：于家乐承德医学院

学位级别：硕士

天然蒽环类抗肿瘤药物阿霉素（doxorubicin,DOX）因对肿瘤细胞缺乏选择性而产生严重毒副作用,其临床应用受到极大限制。使用对肿瘤细胞特异性高表达受体具有高亲和性的多肽类配体通过适当的连接桥与抗肿瘤药物偶联,构建的多肽-药物偶联... 详细信息

天然蒽环类抗肿瘤药物阿霉素（doxorubicin,DOX）因对肿瘤细胞缺乏选择性而产生严重毒副作用,其临床应用受到极大限制。使用对肿瘤细胞特异性高表达受体具有高亲和性的多肽类配体通过适当的连接桥与抗肿瘤药物偶联,构建的多肽-药物偶联物（peptide-drug conjugates,PDCs）能够有效提高药物的肿瘤靶向性。目前,PDC中的多肽类配体多是由天然L-构型氨基酸组成,存在易酶解、生物稳定性不足等缺点,而通过反向序列-构型翻转（retro-inverso）结构改造策略设计得到的由相应D-构型氨基酸组成的多肽类配体具有受体亲和性高、抗酶解性强等优势,有望在提高偶联药物的肿瘤靶向性的同时,进一步提高PDC的稳定性。目的:制备以转铁蛋白受体（transferrin receptor,TfR）亲和肽LT7（肽序列:HAIYPRH）及其retro-inverso衍生物DT7（肽序列:hrpyiah）为配体的多肽-阿霉素偶联物,评价其体外稳定性、释药性能及靶向抗肿瘤活性,为新型低毒、稳定的PDC研究提供思路与参考。方法:***亲和肽-阿霉素偶联物的制备与表征以LT7氮端与DT7碳端分别连接L-半胱氨酸（cysteine,Cys）和D-Cys的衍生肽Cys-LT7（肽序列:CHAIYPRH）、DT7-Cys（肽序列:hrpyiahc）结构中的游离巯基作为活性反应基团,分别与DOX通过异官能团双取代的交联剂3-（2-吡啶二巯基）丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl-3-（2-pyridyldithio）propionate,SPDP)偶联,合成含有分子内二硫键的PDCs（LT7-SS-DOX、DT7-SS-DOX）。采用半制备反相高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）纯化、冷冻干燥后制备得到PDCs纯品,使用分析型HPLC和质谱（ESI-MS）予以表征。***亲和肽-阿霉素偶联物的体外性能评价2.1体外血清稳定性将LT7-SS-DOX或DT7-SS-DOX偶联物与小鼠血清置于37℃恒温条件共同孵育,对孵育液在预设时间点进行取样,沉降血清蛋白后离心,取上清液采用HPLC检测。以零时孵育液中原型PDC的峰面积积分值为100%,根据其它取样时间点孵育液中剩余原型PDC的峰面积积分值占零时峰面积积分值的百分比绘制降解曲线,并计算相应的血清半衰期。2.2体外还原响应性降解将LT7-SS-DOX或DT7-SS-DOX偶联物分别与5 mM和5μM还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）溶液置于37℃恒温条件共同孵育,并在预设时间点取样进行HPLC检测。以上述血清稳定性相似的方法计算各取样时间点孵育液中原型PDC的剩余百分比,对比PDC在体外模拟的肿瘤细胞内还原性微环境（5 m M GSH）和正常细胞内低浓度GSH（5μM）中的降解情况,评价PDC的还原响应性释药性能。***亲和肽-阿霉素偶联物的体外靶向抗肿瘤活性研究选用TfR高表达的U87人脑胶质瘤细胞、HepG2人肝癌细胞、A549人肺癌细胞为肿瘤细胞模型,以TfR低表达的LO2人正常肝细胞作为对照,使用激光共聚焦扫描显微镜分别检测U87细胞、Hep G2细胞、A549细胞和LO2细胞对DOX与PDCs的摄取及药物细胞内定位。应用CCK-8法分别检测DOX与PDCs对U87细胞、Hep G2细胞、A549细胞和LO2细胞的体外细胞毒性,评价PDC的体外靶向抗肿瘤活性。结果:***亲和肽-阿霉素偶联物的制备与表征DOX结构中的氨基与SPDP的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应生成DOX桥连衍生物DOX-SS-Pyr,HPLC测定其纯度为95.3%;ESI-MS（m/z）显示出准分子离子峰[M+H]+为741.1,与其理论相对分子质量740.2吻合;氢谱（1H NMR）数据与文献报道一致,表明成功合成DOX-SS-Pyr。Cys-LT7与DT7-Cys结构中的游离巯基分别与DOX-SS-Pyr的2-吡啶二硫基发生二硫键交换反应,生成目标产物PDCs,经半制备HPLC纯化后得到纯品。HPLC测定LT7-SS-DOX偶联物的纯度为97.3%;ESI-MS（m/z）显示半价离子峰[M+2H]2+为813.3,与其理论相对分子质量1624.6一致。HPLC测定DT7-SS-DOX偶联物的纯度为97.4%;ESI-MS（m/z）显示半价离子峰[M+2H]2+为813.4,与其理论相对分子质量1624.6一致。***亲和肽-阿霉素偶联物的体外性能评价2.1体外血清稳定性随着孵育时间的延长,两种PDCs的原型偶联物在小鼠血清中的剩余百分含量

关键词：转铁蛋白受体多肽-阿霉素偶联物 DT7 还原响应性靶向抗肿瘤活性

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基于因子分析法的绿地集团盈利质量研究

基于因子分析法的绿地集团盈利质量研究

作者：柳家乐长江大学

学位级别：硕士

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高中生物学实验支架式教学的应用研究

高中生物学实验支架式教学的应用研究

作者：司家乐伊犁师范大学

学位级别：硕士

共轭微孔聚合物中空微球基复合材料的制备及其光催化性能研究

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共轭微孔聚合物中空微球基复合材料的制备及其光催化性能研究

作者：于家乐西北民族大学

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基于姿态估计的KOA患者步态识别算法研究

基于姿态估计的KOA患者步态识别算法研究

作者：魏家乐北方民族大学

学位级别：硕士

膝骨性关节炎（Knee Osteo Arthritis,KOA）是一种常见的关节性疾病,严重影响着患者的生活质量,KOA除了会导致关节畸形外,还会引起步态异常,因此,利用步态识别技术诊断KOA具有重要意义。本研究提出了一种基于姿态估计的KOA患者步态识别... 详细信息

膝骨性关节炎（Knee Osteo Arthritis,KOA）是一种常见的关节性疾病,严重影响着患者的生活质量,KOA除了会导致关节畸形外,还会引起步态异常,因此,利用步态识别技术诊断KOA具有重要意义。本研究提出了一种基于姿态估计的KOA患者步态识别算法,通过采集步态数据、提取步态特征、对步态特征分类,实现KOA的步态识别。针对KOA步态数据采集中的设备昂贵、舒适度低问题,提出了一种多维度姿态估计的KOA步态数据采集算法。算法利用单目RGB摄像头采集患者步行视频;通过YOLOV3定位患者在视频中的位置;使用HRNet提取患者关节点2D坐标;采用MHformer得到患者关节点3D坐标;最后基于坐标空间关系计算患者关节角度。实验结果表明,相比专业设备与传感器采集方式,本方法成本降低、舒适度提高,得到的关节角度和Qualisys系统得到的结果在曲线趋势上具有相关性（r>0.8）,在峰角和范围上具有相关性（R>0.25）和一致性（ICC>0.75）。针对KOA步态特征提取中的时域信号步态底层特征模糊问题,提出了一种多特征融合的KOA步态特征提取算法。算法利用EEMD和VMD分别分解信号,得到多条IMF分量;通过边际谱频谱分析分别选取出突出步态底层特征的IMF分量;最后将选取出的IMF分量融合,构建融合特征。实验结果表明,相比时域信号,融合特征的主频个数减少了3个,明确了步态底层特征。针对KOA步态分类中的分类精度不高问题,提出了一种时空信息融合多注意力机制的KOA步态分类算法。算法基于CNN模型构建,为了提高模型的时序特征区分度,引入BiLSTM模块,为了帮助模型聚焦输入中的重点部分,引入Multi-Head Attention机制,最终构建CNN-MABiLSTM模型。实验结果表明,相比机器学习模型RF、SVM、KNN,CNN-MABiLSTM模型的分类准确率分别提高了8.27%、6.76%、9.77%。本研究通过RGB摄像头与姿态估计算法采集步态数据,降低了设备成本、避免了不适感;通过提取融合特征,明确了步态底层特征;通过构建CNN-MABiLSTM模型,提高了步态分类精度。本研究方法实现了KOA步态识别。

关键词：膝骨性关节炎步态识别姿态估计特征融合深度学习