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miRNA调控细胞焦亡及参与糖尿病肾病作用机制的研究进展

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医学综述 2022年第7期28卷 1290-1295页

作者：谭桂湘邹大威首都医科大学北京100069 首都医科大学中医药学院北京100069

细胞焦亡具有多条信号通路,根据其发生机制主要分为经典焦亡通路和非经典焦亡通路,受多种因素以及多条途径的调节。微RNA(miRNA)既可直接调控焦亡信号通路中关键靶蛋白,如含胱天蛋白酶募集域的凋亡相关斑点样蛋白、胱天蛋白酶1、消化道... 详细信息

细胞焦亡具有多条信号通路,根据其发生机制主要分为经典焦亡通路和非经典焦亡通路,受多种因素以及多条途径的调节。微RNA(miRNA)既可直接调控焦亡信号通路中关键靶蛋白,如含胱天蛋白酶募集域的凋亡相关斑点样蛋白、胱天蛋白酶1、消化道皮肤素D等,也可与长链非编码RNA、叉头框转录因子O1、细胞因子信号转导抑制蛋白1等相互作用间接调控细胞焦亡。miRNA可调控细胞焦亡参与糖尿病肾病进展,主要表现在调控肾脏组织固有细胞(肾小管上皮细胞、足细胞、肾系膜细胞)的焦亡和炎症反应。

关键词：糖尿病肾病细胞焦亡微RNA

Bst DNA聚合酶的纯化及等温扩增检测体系的构建

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湖南大学学报（自然科学版） 2019年第12期46卷 98-106页

作者：谭拥军吴莎莎谭桂湘向勤湖南大学生物学院

Bst DNA聚合酶是等温扩增反应中的一个关键酶,但由于专利限制,目前国内实验室所使用的Bst DNA聚合酶大多需要从国外进口,价格昂贵且长途运输影响酶活性,因此亟需自主生产出Bst DNA聚合酶应用于等温扩增检测技术.通过构建Bst Fragement... 详细信息

Bst DNA聚合酶是等温扩增反应中的一个关键酶,但由于专利限制,目前国内实验室所使用的Bst DNA聚合酶大多需要从国外进口,价格昂贵且长途运输影响酶活性,因此亟需自主生产出Bst DNA聚合酶应用于等温扩增检测技术.通过构建Bst Fragement的原核表达质粒,采用原核蛋白表达系统和His-Tag亲和纯化手段,制备成本低,活性高,特异性强的Bst DNA聚合酶.同时,针对特定的模板,对自制Bst DNA聚合酶的扩增反应进行了进一步优化,用不同的产物鉴定方法对扩增效果进行检测,并最终筛选出该酶最优的扩增反应条件为60 mM K^+、30 mM(NH4)2SO4、pH为9.0.最后,验证了Bst DNA聚合酶能用于快速准确检测肺炎支原体、肺炎衣原体,降低了相关病原体核酸检测的成本,为之后核酸检测在基层医疗的更广泛应用提供了条件.

关键词： Bst DNA聚合酶重组蛋白扩增核酸检测

R9-FOXM1(1-234aa)重组蛋白批量纯化及其抑瘤效应研究

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湖南大学学报（自然科学版） 2017年第12期44卷 116-120页

作者：谭拥军余景卫陈燕向勤谭桂湘湖南大学生物学院湖南长沙410082

通过基因工程构建重组表达质粒pET15b-R9-FOXM1(1-234aa),转化大肠杆菌建立构建表达R9-FOXM1(1-234aa)的菌株.采用原核表达系统和His-tag亲和纯化手段,规模化制备纯化穿膜肽R9-FOXM1(1-234aa),获得的蛋白的纯度达到90%以上.用R9-FOXM1(1-234aa)穿膜肽处理不同的肿瘤细胞,通过MTT实验研究其细胞效应.结果显示:当R9-FOXM1(1-234aa)穿膜肽的浓度达到2mM时,肿瘤细胞的死亡率为50%左右.实验表明穿膜肽R9-FOXM1(1-234aa)抑制不同肿瘤细胞的生长,有可能成为治疗肿瘤的潜在蛋白类药物.

关键词：多聚精氨酸细胞穿膜肽 FOXM1 肿瘤治疗

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细胞选择性穿膜肽的穿膜效果研究

湖南大学学报（自然科学版） 2019年第6期46卷 83-87页

作者：谭拥军王坤余雳黄小芹陈燕谭桂湘湖南大学生物学院

细胞穿膜肽是一类能够穿透细胞膜并且不损坏细胞膜结构的小分子多肽,该多肽一般由不多于30个氨基酸组成.针对FITC标记的具有肺癌或肝癌细胞选择性的两种穿膜肽,设置不同浓度梯度,分别处理多种肿瘤细胞,荧光显微镜下观察不同作用浓度下... 详细信息

细胞穿膜肽是一类能够穿透细胞膜并且不损坏细胞膜结构的小分子多肽,该多肽一般由不多于30个氨基酸组成.针对FITC标记的具有肺癌或肝癌细胞选择性的两种穿膜肽,设置不同浓度梯度,分别处理多种肿瘤细胞,荧光显微镜下观察不同作用浓度下细胞中绿色荧光的强弱,并通过流式细胞仪检测含有荧光的细胞数.结果表明:两种细胞穿膜肽具有不同的细胞选择性.CPP33在作用浓度为10μmol/L时能观察到较强的荧光选择性,流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于50%,CPP44在作用浓度为10μmol/L时能观察到较强的荧光选择性,流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于60%.并且随着作用浓度的增加,两种细胞中含有荧光的细胞数不断上升.因此这种针对肿瘤细胞的选择性穿膜肽可能为小分子药物在体内的精确递送提供一种新的方法.

关键词：肿瘤选择性穿膜肽肺癌肝癌浓度梯度小分子药物

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表达大鼠FoxA1的慢病毒制备和鉴定

湖南大学学报（自然科学版） 2012年第3期39卷 58-61页

作者：谭拥军谢骊杨潮何斯佳谭桂湘湖南大学生物学院湖南长沙410082

通过PCR扩增获得大鼠FoxA1的cDNA,构建慢病毒重组载体plv-rFoxA1-IRES-EGFP,并瞬时转染293T细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及Western blot检测FoxA1的表达.通过钙转将该重组载体与辅助质粒△8.91,pVSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.研... 详细信息

通过PCR扩增获得大鼠FoxA1的cDNA,构建慢病毒重组载体plv-rFoxA1-IRES-EGFP,并瞬时转染293T细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及Western blot检测FoxA1的表达.通过钙转将该重组载体与辅助质粒△8.91,pVSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.研究结果表明,大鼠FoxA1慢病毒质粒成功构建,并且证实所制备的慢病毒能感染细胞,使细胞有效表达FoxA1蛋白,为FoxA1的功能研究奠定了材料基础.

关键词：质粒慢病毒 FoxA1基因 PCR

FOXM1_(688-748)结构域相互作用蛋白的鉴定

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湖南大学学报（自然科学版） 2021年第12期48卷 161-165页

作者：谭拥军杨仕平余雳黄小芹陈燕谭桂湘湖南大学生物学院湖南长沙410082

为了鉴定转录因子FOXM1转录激活结构域(C-端第688位到748位氨基酸序列)的互作蛋白,以FOXM1的cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法扩增获得其转录激活结构域序列,克隆进入原核表达载体pGEX-4T2;利用大肠... 详细信息

为了鉴定转录因子FOXM1转录激活结构域(C-端第688位到748位氨基酸序列)的互作蛋白,以FOXM1的cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法扩增获得其转录激活结构域序列,克隆进入原核表达载体pGEX-4T2;利用大肠杆菌原核表达获得融合谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)标签的重组蛋白GST-FOXM1_(688-748);通过GST-pulldown结合质谱方法鉴定FOXM1_(688-748)的互作蛋白,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T2-FOXM1_(688-748),获得了原核表达的重组蛋白GST-FOXM1_(688-748).将质谱鉴定获得的互作蛋白进行分析和归类,预示一些互作蛋白可以参与激活FOXM1的转录活性,如RPN2、MISP、MCM7蛋白,一些互作蛋白可以参与调控FOXM1蛋白的稳定性,如USP9Y、CUL4A、HSPB1、BAG2蛋白.FOXM1蛋白的转录激活结构域与许多不同功能的蛋白发生相互作用,暗示该结构域具有重要的分子生物学作用,期望为以FOXM1为靶点的临床药物研发提供实验依据.

关键词：转录因子FOXM1 FOXM1_(688-748)结构域原核表达相互作用

生物素化FOXM1真核表达体系的构建及鉴定

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生命科学研究 2016年第1期20卷 16-20页

作者：邹红春谭桂湘谭拥军湖南大学生物学院中国湖南长沙410082

建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir ... 详细信息

建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir A真核表达载体pcDNA3.1-Bir A,将pcDNA3.1-AP-FOXM1和pcDNA3.1-BirA共转染人胚肾293T(HEK293T)细胞,用银染及Western印迹检测细胞裂解液,确定相关蛋白表达;用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的FOXM1,并考察FOXM1的互作蛋白是否可以同时被洗脱下来。研究发现构建的生物素标签真核表达体系能有效表达生物素化的目标蛋白FOXM1;该蛋白在Western印迹、pull-down等实验中可实现无需抗体的一步法应用;该体系可用于FOXM1互作蛋白的鉴定和功能分析。结果表明建立了基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达体系,为FOXM1互作蛋白与功能的深入研究奠定了技术基础。

关键词：生物素化FOXM1 BirA生物素连接酶 HEK 293T细胞亲和纯化蛋白印迹

基于CRISPR/Cas9系统构建FOXA2表达示踪体系

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生物技术通报 2018年第5期34卷 80-86页

作者：程浩杰张振旺谭桂湘刘昱翔卜会铜谭拥军湖南大学生物学院长沙410082

利用CRISPR/Cas9系统在基因FOXA2蛋白质编码区后插入绿色荧光蛋白核酸序列,实现对FOXA2基因开启和关闭的示踪。通过靶向序列选择、Cas9靶向质粒及Donor片段的克隆、细胞转染并进行流式细胞荧光分选、阳性细胞有限稀释、富集培养及单克... 详细信息

利用CRISPR/Cas9系统在基因FOXA2蛋白质编码区后插入绿色荧光蛋白核酸序列,实现对FOXA2基因开启和关闭的示踪。通过靶向序列选择、Cas9靶向质粒及Donor片段的克隆、细胞转染并进行流式细胞荧光分选、阳性细胞有限稀释、富集培养及单克隆细胞的鉴定和转录翻译水平验证等5个方面,进行实验研究。在编辑的乳腺肿瘤细胞MCF-7中,绿色荧光蛋白有效表达;乳腺癌细胞内绿色荧光蛋白的表达水平同FOXA2蛋白的表达水平正相关,且经肿瘤细胞上皮间质转化进程诱导因子EGF的诱导,绿色荧光蛋白和FOXA2表达水平同步降低。方法学上CRISPR/Cas9靶向FOXA2并利用细胞内同源性定向修复插入绿色荧光蛋白序列成功;利用报告基因蛋白表达水平示踪目的基因的开启、关闭及表达量高低结果准确、方法简单,效果明显。

关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑 FOXA2 示踪乳腺癌 MCF-7 上皮间质转化

上皮性卵巢癌Rac1b表达水平与TP方案新辅助化疗疗效的相关性研究

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肿瘤药学 2012年第4期2卷 283-285页

作者：曾勇谌赟汪砥谭桂湘伍奕任华益湖南省肿瘤医院湖南长沙410013 中南大学湘雅医院湖南长沙410078 湖南大学生物学院湖南长沙410013

目的分析上皮性卵巢癌组织中Rac1b表达水平与TP方案新辅助化疗临床疗效的关系。方法收集上皮性卵巢癌组织标本20例,按照是否采用新辅助化疗手段治疗分为实验组与对照组,其中实验组9例,对照组11例。比较采用TP方案新辅助化疗后手术切除... 详细信息

目的分析上皮性卵巢癌组织中Rac1b表达水平与TP方案新辅助化疗临床疗效的关系。方法收集上皮性卵巢癌组织标本20例,按照是否采用新辅助化疗手段治疗分为实验组与对照组,其中实验组9例,对照组11例。比较采用TP方案新辅助化疗后手术切除上皮性卵巢癌组织与直接手术切除上皮性卵巢癌组织中Rac1b表达水平,并对两组患者开展为期18个月的随访观察,比较两组患者临床疗效与Rac1b表达水平之间的关系。结果实验组Rac1b阳性面积百分率(%)为37.2±5.3,对照组Rac1b阳性面积百分率(%)为6.9±1.1,差异有统计学意义(P0.05)。对两组患者在随访12个月进行临床疗效分析,结果显示实验组有效率为55.6%,对照组有效率为54.5%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Rac1b的表达水平与化疗药物的使用间存在较为明确的关联。

关键词：上皮性卵巢癌 Rac1b 新辅助化疗