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雷帕霉素或二甲双胍联合PD-1单抗在三阴性乳腺癌中的抗肿瘤作用

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雷帕霉素或二甲双胍联合PD-1单抗在三阴性乳腺癌中的抗肿瘤作用

作者：谭晓颖山东大学

学位级别：硕士

研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,也是女性癌症死亡的主要原因之一,严重威胁着女性的生命健康。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中恶性程度最高的亚型,由于缺乏有效化疗方案及靶向药物,治疗手段比较单... 详细信息

研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,也是女性癌症死亡的主要原因之一,严重威胁着女性的生命健康。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中恶性程度最高的亚型,由于缺乏有效化疗方案及靶向药物,治疗手段比较单一,因此寻找新的有效治疗方法对TNBC患者至关重要。近年来,针对PD-Ll/PD-1(programmed death-ligand 1/programmed death-1)的免疫检查点阻断疗法取得巨大成功,截至目前,部分PD-1或PD-L1阻断药物已经被FDA批准用于部分恶性肿瘤患者的治疗。乳腺癌患者中开展的PD-L1或PD-1单克隆抗体治疗研究表明,TNBC患者可于PD-1/PD-L1阻断疗法中获益。但由于患者之间的个体差异以及肿瘤免疫逃逸机制不同等原因,PD1/PD-L1阻断疗法的有效率较低,因此,提高癌症患者对于PD-1/PD-L1阻断疗法的反应性引起越来越多的关注。最新的研究表明,部分靶向治疗除了具备直接杀伤肿瘤细胞的作用,还可以使患者对免疫治疗敏感化。因此,靶向治疗和免疫治疗的联合应用不仅能达到两种治疗的相加效果,更能发挥协同效应。PI3K/AKT/mTOR通路可以调控肿瘤表面PD-L1的表达,同时有研究表明mTOR抑制剂雷帕霉素以及靶向AMPK/mTOR的二甲双胍可以通过调节免疫系统发挥抗癌作用。因此,我们认为PD-1抗体联合雷帕霉素或者二甲双胍是值得探讨的联合治疗方式,本研究将验证其在TNBC中的治疗效果,并探讨协同作用的机制,为新的TNBC治疗方式提供理论基础。研究目的1.评估mTOR抑制剂雷帕霉素及二甲双胍对乳腺癌细胞PD-L1表达的影响。2.建立TNBC小鼠模型,评估PD-1抗体与雷帕霉素或者二甲双胍联合治疗TNBC的效果,并初步探究其作用机制。实验方法1.通过分析TCGA数据库数据,比较PD-L1 mRNA在TNBC组织与Non-TNBC组织中的表达情况;分析CCLE数据库数据,比较TNBC与Non-TNBC细胞系中PD-L1 mRNA表达情况。2.利用RT-qPCR及Western Blot(WB)检测乳腺癌细胞系中PD-L1的表达;WB检测乳腺癌细胞系mTOR通路活化状态;筛选MDA-MB-231与4T1用于下一步实验,利用流式细胞术检测细胞膜表面PD-L1表达。3.雷帕霉素处理MDA-MB-231与4T1细胞系不同时间,WB检测pS6、S6、PD-L1蛋白变化;二甲双胍处理MDA-MB-231细胞系24h,检测pS6、S6、pAMPK、AMPK、PD-L1蛋白变化。4.构建小鼠乳腺癌移植瘤模型,分为对照组、施用雷帕霉素组、施用二甲双胍组,用药三周,统计雷帕霉素或二甲双胍在小鼠体内对肿瘤增殖及转移的影响,评估雷帕霉素或二甲双胍的抗肿瘤效果。5.构建小鼠移植瘤模型,分为对照组、雷帕霉素组、PD-1组、雷帕霉素联合PD-1组,用药三周,评估单药及联合用药对肿瘤生长的影响。6.利用HE染色评估肿瘤细胞的形态学改变;免疫荧光及免疫组化检测小鼠肿瘤组织的PD-L1、pS6、active casepase-3、CD3表达情况。7.构建小鼠移植瘤模型,分为对照组、二甲双胍组、PD-1组、二甲双胍联合PD-1组,评估单药及联合用药对肿瘤生长的影响。8.利用免疫荧光及免疫组化检测小鼠肿瘤的PD-L1、pS6、activecasepase-3、CD3表达情况。实验结果1.TNBC组织PD-L1 mRNA水平显著高于Non-TNBC组织,差异有统计学意义。虽然没有统计学意义,TNBC细胞系PD-L1 mRNA整体表达高于Non-TNBC。2.体内外实验结果表明,雷帕霉素与二甲双胍无论在体外,还是体内,均能降低PD-L1表达,这种作用与mTOR通路的抑制有关。3.小鼠体内实验证明雷帕霉素与二甲双胍均能降低肿瘤瘤重,减少肺转移,差异有统计学意义。4.小鼠体内实验显示,PD-1单抗、雷帕霉素、雷帕霉素联合PD-1单抗均能显著抑制肿瘤生长,降低瘤重,联合用药较单药效果更加显著,差异具有统计学意义;PD-1单抗、二甲双胍、二甲双胍联合PD-1单抗均能显著抑制肿瘤的生长,降低瘤重,联合用药较单用二甲双胍的抗肿瘤作用更加显著,差异有统计学意义;虽然联合用药组瘤重低于PD-1单抗组,但差异没有统计学意义。5.雷帕霉素与PD-1组联合用药HE染色显示雷帕霉素组肿瘤大片坏死,PD-1组肿瘤坏死较轻,但肿瘤细胞密度降低,并出现纤维组织增生,联合用药组兼具这两种表现且坏死面积更大。免疫荧光及免疫组化结果显示,联合用药增加了CD3及活性casepase-3的表达,显示联合用药增加了肿瘤浸润淋巴细胞与细胞凋亡。6..二甲双胍组与PD-1联合用药,联合用药CD3表达及活性casepase-3表达增加,显示联合用药增加了肿瘤浸润淋巴细胞与细胞凋亡。结论1.相比于单独用药,雷帕霉素与PD-1单抗

关键词： PD-1 雷帕霉素二甲双胍三阴性乳腺癌

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绵羊同种及绵羊—山羊异种核移植研究

绵羊同种及绵羊—山羊异种核移植研究

作者：谭晓颖西北农林科技大学

学位级别：硕士

在绵羊同种及绵羊-山羊异种克隆胚构建过程中,为了完善克隆胚构建及培养体系,就离子霉素和乙醇分别联合6-D的激活、不同的融合和化学激活前培养时间和不同阶段添加饲养层对克隆胚发育的影响三个方面进行了研究。对绵羊同种核移植所得流... 详细信息

在绵羊同种及绵羊-山羊异种克隆胚构建过程中,为了完善克隆胚构建及培养体系,就离子霉素和乙醇分别联合6-D的激活、不同的融合和化学激活前培养时间和不同阶段添加饲养层对克隆胚发育的影响三个方面进行了研究。对绵羊同种核移植所得流产胎儿进行了分子生物学检测,结果表明: 1. 5mmol/L离子霉素联合6-D激活同种克隆胚胎和异种克隆胚胎5min,其卵裂率、桑椹胚和囊胚发育率虽均高于7%乙醇联合6-D激活胚胎5min(同种依次为79.67%Vs73.39%、44.79% Vs 35.08 %以及11.97% Vs 8.18%,异种依次为76.00% Vs 72.13%、36.84% Vs 35.60%以及9.77% Vs 6.82%),但差异不显著(P>0.05),同种克隆和异种克隆胚胎比较,差异不显著(P>0.05)。表明易得到的乙醇可以替代离子霉素。 2.融合前平衡1h的同种和异种胚胎卵裂率,桑椹胚率均比不平衡直接融合明显高(同种76.88% ,76.70% Vs 64.49%,63.16%;52.85%,43.04% Vs33.33%,28.33%;异种为76.09%,77.53%Vs70.09%,63.33%;46.07%,44.93% Vs 30.67%,28.07%)(P0.05)),同种克隆和异种克隆胚比较,异种克隆胚的卵裂率和囊胚率明显低于同种克隆胚胎。而在72h之后添加饲养层共培养,桑椹胚和囊胚发育率与未添加的差异均不显著(P>0.05)(桑椹胚率同种31.47% vs 40.0 % vs 51.48%;异种,37.84% vs 39.22% vs 51.48%,囊胚率同种,7.69% vs 10.67 % vs 14.79%;异种,3.60% vs 5.88% vs 7.32%)。结果表明对同种和异种克隆胚胎而言,在前72h进行共培养,有利于胚胎的发育,而72h之后不需要饲养层共培养即可,同种克隆和异种克隆胚胎比较,差异不显著(P>0.05)。 4.筛选5对微卫星引物对体细胞克隆绵羊流产胎儿DNA进行PCR扩增,12%聚丙烯凝胶电泳,硝酸银染色克隆胎儿的微卫星DNA指纹与供体细胞完全相同,而不同于其受体母亲和对照绵羊。证明该流产羔羊基因来源于供体细胞,为体细胞克隆绵羊。用Sry基因特异性引物扩增发现流产胎儿和供核细胞一样均为雄性,进一步证实了该流产胎儿为体细胞克隆绵羊。

关键词：绵羊山羊核移植异种核移植微卫星DNA

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饮用普洱熟茶对人肠道菌群的影响

临床消化病杂志 2022年第2期34卷 100-105页

作者：谭晓颖张晓慧许岸高广东省惠州市第一人民医院消化内科广东惠州516001 广东省惠州市医学研究所广东惠州516003

[目的]研究饮用普洱熟茶12周是否会使人的肠道菌群发生变化,为普洱熟茶的保健作用提供科学参考数据。[方法]按照实验的纳入和排除标准筛选30例志愿者作为受试对象,采集其粪便样本(2~5 g)置于无菌容器中,于4 h内放入-80℃冰箱内冷藏待检... 详细信息

[目的]研究饮用普洱熟茶12周是否会使人的肠道菌群发生变化,为普洱熟茶的保健作用提供科学参考数据。[方法]按照实验的纳入和排除标准筛选30例志愿者作为受试对象,采集其粪便样本(2~5 g)置于无菌容器中,于4 h内放入-80℃冰箱内冷藏待检。给予受试者每日饮用同一生产批次、同一产地的普洱熟茶12周(早、中、晚分别饮用3 g普洱熟茶,每日共计饮用9 g)。干预12周后,再次按同样方法采集大便并冻存。收集完标本后,统一提取粪便标本总DNA,并进行16 SrRNA高通量测序及肠道菌群多样性分析。通过统计学方法分析,对比受试者饮用普洱熟茶前后粪便肠道菌群的变化情况。[结果]与饮用普洱熟茶前相比,受试者饮茶后的肠道细菌物种丰度及多样性有一定改变,但差异无统计学意义(P>0.05)。受试者饮茶前后的肠道菌群群落的结构比较差异有统计学意义(R=0.171,P=0.001)。饮茶后肠道菌群在各分类水平上的数量存在一定变化,其中乳酸杆菌、双歧杆菌、Akkermansia等有益菌属数量明显增加,与饮茶前比较差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]饮用普洱熟茶12周后肠道菌群的群落结构向对机体有益的趋势转变,其变化具有显著统计学意义。

关键词：肠道菌群普洱茶(熟茶) 高通量测序

山羊-绵羊异质克隆胚在G1/G2培养液中发育的可能性

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西北农业学报 2009年第1期18卷 1-5页

作者：谭晓颖贾文文窦忠英西北农林科技大学动物医学院陕西省干细胞工程技术研究中心陕西杨凌712100

以山羊皮肤成纤维细胞为供体细胞,绵羊去核卵母细胞为受体细胞进行种间体细胞核移植,构建山羊-绵羊重构胚,并采用G1/G2培养液对其进行体外培养,比较G1/G2培养不同阶段添加饲养层对山羊-绵羊种间体细胞核移植重构胚发育的效果。结果表明... 详细信息

以山羊皮肤成纤维细胞为供体细胞,绵羊去核卵母细胞为受体细胞进行种间体细胞核移植,构建山羊-绵羊重构胚,并采用G1/G2培养液对其进行体外培养,比较G1/G2培养不同阶段添加饲养层对山羊-绵羊种间体细胞核移植重构胚发育的效果。结果表明,共构建获得山羊-绵羊重构胚472枚,重构胚能够在G1/G2连续培养基中发育至囊胚阶段;仅在G1中添加饲养层与对照组不添加饲养层相比,前者能获得较好的分裂率和桑囊率,差异不明显(卵裂率为76.88%vs 67.11%,桑椹胚率为52.84%vs 39.22%,囊胚发育率为7.32%vs 5.88%),而仅在G2阶段共培养与对照组相比培养桑囊率较低,差异不显著(卵裂率为69.38%vs67.11%,桑椹胚率为37.84%vs 39.22%,囊胚发育率为3.60%vs 5.88%),即,对于绵羊-山羊重构胚的培养,在前期(G1中)添加颗粒细胞培养重构胚效果优于仅在后期共培养(卵裂率为76.88%vs 69.38%,桑椹胚率为52.84%vs 37.84%,囊胚发育率为7.32%vs 3.60%)。

关键词：异质重构胚体外培养 G1/G2 山羊绵羊

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滤前全血温度对白细胞去除效果的影响

中国实用医药 2022年第17期17卷 192-194页

作者：卢少芬谭晓颖杜明仪陈雪英龙海燕广东省肇庆市中心血站 526040

目的探讨滤前全血温度对白细胞去除效果的影响。方法 45袋200 ml的滤前全血,按滤前全血温度不同分成热滤组、温滤组、冷滤组,每组15袋。热滤组血液采集后置于18℃~25℃室温3 h;温滤组血液采集后置于2℃~6℃低温操作柜>1.5 h,使其血液温... 详细信息

目的探讨滤前全血温度对白细胞去除效果的影响。方法 45袋200 ml的滤前全血,按滤前全血温度不同分成热滤组、温滤组、冷滤组,每组15袋。热滤组血液采集后置于18℃~25℃室温3 h;温滤组血液采集后置于2℃~6℃低温操作柜>1.5 h,使其血液温度3 h。三组均进行全血白细胞过滤。比较三组全血过滤前后血液指标及过滤时间、去白细胞全血质量检测结果。结果全血过滤前,三组全血容量、血红蛋白含量、白细胞含量比较,差异无统计学意义(P>0.05);全血过滤后,三组全血容量、血红蛋白含量、白细胞含量均低于本组全血过滤前,且冷滤组白细胞含量(0.5±0.3)×10~6/L低于温滤组的(1.5±1.1)×10~6/L和热滤组的(2.7±1.6)×10~6/L,温滤组白细胞含量低于热滤组,差异有统计学意义(P0.05)。冷滤组去白细胞全血合格率为100.0%,温滤组去白细胞全血合格率为93.3%,均满足质控要求的75.0%,热滤组去白细胞全血合格率为60.0%,达不到去白细胞全血的质量要求。冷滤组、温滤组去白细胞全血合格率高于热滤组,三组去白细胞全血合格率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论滤前全血温度对白细胞去除效果有明显影响,最好将温度控制为<14℃或2℃~6℃,整个冷链环境温度控制为影响过滤效果的重要因素。

关键词：血液过滤全血温度白细胞影响