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吴茱萸碱对肿瘤血管增生的抑制作用及其机制

医药导报 2023年第9期42卷 1305-1311页

作者：刘磊彭琴吴泽明黄欣慧张广献谭宇蕙广州中医药大学基础医学院广州510006

目的探讨吴茱萸碱对肿瘤血管增生的抑制作用及其机制。方法以不同浓度的吴茱萸碱、二氯化钴(CoCl_(2))单独或联合处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)或人肝癌细胞(HepG2)24 h。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖水平变化;Annexin V/PI双染流式... 详细信息

目的探讨吴茱萸碱对肿瘤血管增生的抑制作用及其机制。方法以不同浓度的吴茱萸碱、二氯化钴(CoCl_(2))单独或联合处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)或人肝癌细胞(HepG2)24 h。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖水平变化;Annexin V/PI双染流式细胞术检测吴茱萸碱对HUVECs凋亡的影响;采用CoCl_(2)化学诱导法建立HUVECs体外模拟缺氧模型;免疫印迹法(Western blotting)检测HUVECs的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、代谢酶(PFKFB3)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)蛋白表达水平。结果MTT检测结果显示,吴茱萸碱对HUVECs、HepG2细胞增殖均有显著的抑制作用(P<0.05或P<0.01),半数抑制浓度分别为1.15、1.07μmol·L^(-1)。流式细胞术结果表明,吴茱萸碱可以诱导HUVECs凋亡(P<0.01)。在常氧条件下,吴茱萸碱对HUVECs的HIF-1α、PFKFB3蛋白抑制不明显,但能显著下调VEGFR2蛋白表达水平(P<0.01)。5~50μmol·L^(-1) CoCl_(2)可使HUVECs的HIF-1α和PFKFB3蛋白表达水平显著升高(P<0.01),且呈浓度依赖性,而细胞增殖水平未见明显变化,但100~400μmol·L^(-1) CoCl_(2)时细胞生存率明显升高;800μmol·L^(-1) CoCl_(2)时细胞生存率明显降低(P<0.01)。CoCl_(2)诱导HIF-1α高表达条件下,吴茱萸碱(0.4μmol·L^(-1))能显著下调HIF-1α、PFKFB3和VEGFR2的蛋白表达水平和细胞生存率(P<0.01);与吴茱萸碱组比较,联合(吴茱萸碱+CoCl_(2))组HIF-1α、PFKFB3蛋白水平及细胞生存率均上调(P<0.05),而VEGFR2不上调。结论吴茱萸碱对HUVECs和HepG2细胞增殖均有显著的抑制作用,且诱导HUVECs凋亡;在CoCl_(2)模拟缺氧条件下,吴茱萸碱可显著下调HUVECs的糖酵解(Warburg效应),其机制可能与独立下调HIF和VEGFR两条信号通路有关。

关键词：吴茱萸碱血管增生糖酵解缺氧诱导因子血管内皮生长因子受体

六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗黑色素瘤增效作用的缝隙连接机制初探

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中国中西医结合杂志 2013年第5期33卷 651-658页

作者：杜标炎郭玉荣易华谭宇蕙吴映雅广州中医药大学基础医学院病理教研室广州510006 广西柳州市中医院科教科广西545001 广州中医药大学基础医学院生化教研室广州510006

目的探讨六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞增效作用的缝隙连接机制。方法制备六味地黄丸含药血清(分别为2.5%、5.0%、10.0%六味血清)及10.0%对照血清。采用RT-PCR法检测六味地黄丸含药血清对B16... 详细信息

目的探讨六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞增效作用的缝隙连接机制。方法制备六味地黄丸含药血清(分别为2.5%、5.0%、10.0%六味血清)及10.0%对照血清。采用RT-PCR法检测六味地黄丸含药血清对B16细胞株的缝隙链接蛋白(Cx)26和Cx43 mRNA的影响,Western blot法和间接免疫荧光法检测其对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响;RT-PCR检测Cx26-309、Cx26-337、Cx26-367、Cx26-2098 SiRNA对Cx26的干扰效率,选用干扰效率最高的Cx26-2098 SiRNA干扰Cx26基因后观察六味地黄丸联合HSV-tk/GCV的旁观者效应;MTT法检测细胞间缝隙连接通讯功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)抑制剂甘草次酸(GA)对六味地黄丸联合tk/GCV系统对B16细胞杀伤作用的影响,实验设为对照血清组,2.5%、5.0%、10.0%六味血清组(简称低、中、高剂量组)及对照血清联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV加GA组。GCV终浓度为20mol/L,GA终浓度为50mol/L。结果六味地黄丸含药血清能提高B16细胞中Cx43mRNA及蛋白的表达,且具有量效依赖关系;对Cx26 mRNA与蛋白的表达具有双向调节作用,低剂量时具有抑制作用而高剂量是能上调其表达;SiRNA干扰Cx26基因表达后,六味地黄丸联合自杀基因治疗的旁观者效应与没有干扰前比较无明显的变化;低、中、高剂量联合GCV组在GA阻断前细胞抑制率(48.75%、59.39%、69.28%)与阻断后细胞抑制率(29.14%、38.71%、58.13%)比较,显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤恶性黑色素瘤B16细胞的增效作用与缝隙连接机制有关,可能是通过提高Cx26和Cx43等缝隙连接蛋白表达而达到协同增效作用。

关键词：恶性黑色素瘤基因治疗自杀基因六味地黄丸血清药理学缝隙连接

六味地黄丸入血成分对自杀基因杀伤B16细胞的增效作用

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中药新药与临床药理 2014年第2期25卷 153-158页

作者：张广献王苏萍曾玲谭宇蕙吴映雅杜标炎广州中医药大学生化教研室广东广州510006 广州中医药大学病理教研室广东广州510006

目的探讨六味地黄丸主要入血成分对自杀基因系统(HSV-tk/GCV)杀伤黑色素瘤B16细胞的增效作用及作用机制。方法采用MTT法检测六味地黄丸主要入血成分丹皮酚、马钱素、莫诺苷、5-羟甲基-2-糠酸和獐牙菜苷5种化合物及其混合组分对HSV-tk/GC... 详细信息

目的探讨六味地黄丸主要入血成分对自杀基因系统(HSV-tk/GCV)杀伤黑色素瘤B16细胞的增效作用及作用机制。方法采用MTT法检测六味地黄丸主要入血成分丹皮酚、马钱素、莫诺苷、5-羟甲基-2-糠酸和獐牙菜苷5种化合物及其混合组分对HSV-tk/GCV杀伤B16细胞的影响;入血成分混合组分处理脾淋巴细胞后培养上清对HSV-tk/GCV杀伤B16细胞的影响;荧光显微镜观察及流式细胞术结合荧光示踪法分析含药淋巴细胞上清对细胞间缝隙连接通讯(GJIC)功能的影响及Western blot分析缝隙连接蛋白(Cx43)表达;MTT法检测含药淋巴细胞上清对HSV-tk/GCV杀伤B16细胞的增敏作用。结果 HSV-tk/GCV联合丹皮酚、马钱素、莫诺苷、5-羟甲基-2-糠酸和獐牙菜苷5种化合物及5种化合物的混合组分,均未显示其对自杀基因的杀伤有直接增效作用;而混合组分处理脾淋巴细胞后培养上清对HSV-tk/GCV杀伤B16细胞具有协同增效作用,并呈一定的量效关系。含药淋巴上清可明显促进Cx43表达,改善B16细胞间缝隙通讯功能。含药淋巴上清对HSV-tk/GCV的B16细胞杀伤敏感性则无明显影响。结论六味地黄丸主要入血成分可能刺激脾淋巴细胞产生某些活性物质,并对HSV-tk/GCV杀伤B16细胞起增效作用,这些淋巴细胞产生的免疫活性物质可能才是六味地黄丸对肿瘤自杀基因疗法增效作用的药效物质基础;其增效机制可能与改善B16细胞间GJIC相关。

关键词：六味地黄丸 HSV-tk GCV系统 B16细胞旁杀伤

吴茱萸碱联合CDK1抑制剂RO3306对鼠结肠癌CT26的协同杀伤作用

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世界华人消化杂志 2011年第12期19卷 1244-1250页

作者：崔娟吴映雅谭宇蕙张广献杜标炎常金荣广州中医药大学生化教研室广东省广州市510006 广州中医药大学病理教研室广东省广州市510006 广州中医药大学中医基础公共实验室广东省广州市510006

目的:探讨吴茱萸碱(EVO)联合CDK1的特异抑制剂RO3306对鼠结肠癌细胞CT26的生长抑制、诱导凋亡是否有协同增效作用.方法:采用MTT法求出EVO对CT26作用24h的IC50及诱导CT26细胞发生不可逆凋亡的时间点,比较EVO和RO3306同时用药与序贯用药(... 详细信息

目的:探讨吴茱萸碱(EVO)联合CDK1的特异抑制剂RO3306对鼠结肠癌细胞CT26的生长抑制、诱导凋亡是否有协同增效作用.方法:采用MTT法求出EVO对CT26作用24h的IC50及诱导CT26细胞发生不可逆凋亡的时间点,比较EVO和RO3306同时用药与序贯用药(EVO先作用24h,再加入RO3306共同作用6h)对CT26细胞的抑制作用.采用金正均q值法检验其联合作用是否有协同性(q为实际药效与理论药效比值,q>1.15为协同性).同时用药实验与序贯用药实验的分组情况均为对照组、2mg/LEVO组,4mg/LEVO组,15mg/LRO3306组(加药时间同相应联合组),2mg/LEVO+15mg/LRO3306联合组,4mg/LEVO+15mg/LRO3306联合组.采用克隆集落形成法检测药物单独和联合作用下对CT26细胞的抑制率.采用流式细胞术检测药物作用对CT26凋亡率的影响.结果:MTT法结果显示EVO对结肠癌细胞CT26具有显著抑制作用,其抑制作用有明显的浓度依赖性,作用24h的IC50为10.8mg/L;EVO诱导CT26细胞进入不可逆凋亡的时间点在24h左右.MTT检测EVO和RO3306序贯用药的各组抑制率依次分别是22.0%±4.4%、30.4%±3.2%、12.3%±4.8%、48.0%±3.2%、62.2%±2.2%(序贯用药联合组q=1.52,1.60>1.15,同时加药联合组q=0.68,0.72).克隆集落形成法显示相应各组的抑制率依次分别是9.7%±5.8%、38.9%±3.8%,10.8%±3.7%,29.8%±10.7%,68.3%±12.7%(q>1.15).流式细胞术显示各组细胞凋亡率依次分别是5.5%±1.1%,18.3%±1.9%,25.6%±1.5%,9.2%±1.1%,39.1%±9.8%,54.6%±1.2%(q>1.15).结论:EVO能抑制鼠结肠癌细胞CT26的生长,其作用呈剂量依赖关系,EVO诱导CT26发生不可逆凋亡的时间点约在24h左右;EVO联合CDK1抑制剂RO3306并序贯用药对CT26的抑制作用具有协同增效效应,同时加药联合作用未显示协同性.

关键词：吴茱萸碱 CDK1抑制剂细胞凋亡 M期阻滞 M期滑移

LZ-8基因克隆及其在毕赤酵母中的诱导表达

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广州中医药大学学报 2012年第1期29卷 66-69页

作者：肖建勇谭宇蕙李刚李宝健广州中医药大学基础医学院生物化学教研室广东广州510006 中山大学生物工程研究中心基因工程教育部重点实验室广东广州510275

【目的】从灵芝中克隆LZ-8基因并在毕赤酵母表达系统中诱导表达LZ-8蛋白。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)法从赤灵芝的基因组DNA中扩增LZ-8基因序列,采用电激转化法将pPLZ8-X重组质粒转化到毕赤酵母中,PCR Southernblot法检测酵母是否转... 详细信息

【目的】从灵芝中克隆LZ-8基因并在毕赤酵母表达系统中诱导表达LZ-8蛋白。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)法从赤灵芝的基因组DNA中扩增LZ-8基因序列,采用电激转化法将pPLZ8-X重组质粒转化到毕赤酵母中,PCR Southernblot法检测酵母是否转化LZ-8基因,十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并银染法观察蛋白在酵母中的差异表达。【结果】PCR Southern blot结果显示LZ-8基因已转化到酵母中;SDS-PAGE胶银染结果提示LZ-8蛋白在酵母中被诱导表达。【结论】免疫调节蛋白基因LZ-8在毕赤酵母表达系统获得了诱导表达。

关键词：灵芝基因克隆基因表达

丹参注射液对自杀基因tk/GCV系统的协同增效作用

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中国药理学通报 2006年第3期22卷 291-295页

作者：谭宇蕙吴映雅王慧峰岳文玲杜标炎广州中医药大学生物化学教研室广东广州510407 广州中医药大学病理学教研室广东广州510407

目的探讨丹参注射液联合自杀基因系统对大鼠肝癌细胞和小鼠移植瘤的作用。方法 ①丹参注射液以不同浓度与GCV分别或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919的tk^-细胞，以及含5％tk^＋的tk^＋、tk^-混合细胞，MTT法检测各组存活率，用Q值（实测药... 详细信息

目的探讨丹参注射液联合自杀基因系统对大鼠肝癌细胞和小鼠移植瘤的作用。方法 ①丹参注射液以不同浓度与GCV分别或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919的tk^-细胞，以及含5％tk^＋的tk^＋、tk^-混合细胞，MTT法检测各组存活率，用Q值（实测药效与理论药效的比值）分析中药与自杀基因系统联合的相互作用是否有协同性，0．85≤Q〈1．15为相加；Q≥1．15为协同。②把小鼠肝癌细胞H22／tk（tk^＋）与H22（tk^-）细胞按1：4混合，再按2×10^6细胞/只接种到Balb／c纯系小鼠腋下皮下组织内，随机分为模型组、丹参（注射液）组、tk／GCV组、tk／GCV联合丹参注射液治疗的联合组，n=9～11；中药治疗从d2起共15d，自杀基因系统治疗从长出肿瘤后开始共10d，进行疗效观察。结果 ①各组存活率tk／GCV组为63．10％±2．17％，GCV组为67．03％±2．81％，5ml·L^-1丹参联合tk／GCV组为26．67％±4．23％（Q=1．22），5ml·L^-1丹参＋GCV组为42．17％±5．36％（Q=1．04）；10ml·L^-1丹参联合tk／GCV组为18．10％±5．56％（Q=1．26），10ml·L^-1丹参＋GCV组为33．84％±9．84％（Q=1．06）。②接种后各组均在d7触摸到肿瘤，成瘤率100％。联合组在治疗后肿瘤生长呈现明显抑制，最终肿瘤体积（1．53±0．88）cm^3，比模型组（3．19±1．76）cm^3减少52．01％（P〈0．05）；肿留质量（1．32±0．80）g，比模型组（2．28±1．20）g减少42．11％（P〈0．05），差异有统计学意义。丹参组、tk／GCV组肿瘤体积、瘤块质量与模型组比较差异均无统计学意义。结论丹参注射液能提高自杀基因系统对大鼠肝癌细胞的杀伤力和对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制作用，两者联合作用的协同性提示丹参注射液能增强自杀基因旁观者效应。

关键词：丹参自杀基因旁观者效应肝肿瘤

从Cx26探究六味地黄丸增效肝癌自杀基因治疗的机制

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中华中医药杂志 2009年第9期24卷 1200-1204页

作者：易华杜标炎谭宇蕙孙军吴映雅李杰芬郭晶广州中医药大学基础医学院广州510006 暨南大学水生生物研究所广州510630 广州中医药大学广州510405

目的:探讨六味地黄丸对大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx26表达的影响,初步阐明其对自杀基因治疗的增效作用是否与缝隙连接机制相关。方法:应用血清药理学研究方法制备六味地黄丸含药血清。采用MTT法检测六味地黄丸含药血清联合单纯疱疹病毒-胸... 详细信息

目的:探讨六味地黄丸对大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx26表达的影响,初步阐明其对自杀基因治疗的增效作用是否与缝隙连接机制相关。方法:应用血清药理学研究方法制备六味地黄丸含药血清。采用MTT法检测六味地黄丸含药血清联合单纯疱疹病毒-胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)自杀基因系统治疗的杀伤效应:应用蛋白印迹(Western blot)技术、间接免疫荧光法及荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测其对CBRH7919细胞株Cx26蛋白及mRNA表达的影响。结果:①六味地黄丸含药血清联合自杀基因治疗组肝癌细胞存活率明显低于单纯自杀基因组(10%tk+/GCV加对照血清)(P1.15);②Western blot检测显示六味地黄丸含药血清能提高Cx26蛋白的表达,并有明显的量效关系;③间接免疫荧光法(FITC)法共聚焦显微镜观测显示近似的结果:蛋白定位于细胞膜和胞浆,尤其在细胞膜的表达明显增多,含药血清组的Cx26蛋白荧光强度比对照组明显增加(P<0.05)。结论:六味地黄丸增强自杀基因旁杀伤效应的机制与其促进肝癌细胞Cx26 mRNA及蛋白表达,增加膜上定位表达进而改善细胞间连接通讯(GJIC)功能有关。

关键词：肝癌六味地黄基因治疗血清药理学缝隙连接

基于问卷调查的生物化学学习现状分析及教改思考

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教育现代化 2019年第62期 56-59页

作者：李红谭宇蕙广州中医药大学基础医学院医学生物技术系

生物化学是医药类专业的必修基础课程,因其内容多、知识结构复杂等特点,学生普遍反映该课程难度大不好学。为提升教学效果、调动学生学习积极性,本文对学生学习生化的相关情况进项调查,并基于调查结果进行分析探讨教学改革方案。

关键词：生物化学教学改革教学手段实验教学自主学习

白藜芦醇诱导鼻咽癌CNE-1细胞凋亡及其分子机制

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中药新药与临床药理 2014年第2期25卷 131-135页

作者：赵青谭宇蕙吴映雅张广献杜标炎肖建勇广州中医药大学基础医学院广东广州510006

目的探讨白藜芦醇诱导鼻咽癌CNE-1细胞凋亡及其分子机制。方法噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力;活细胞染色法(PI)流式细胞仪分析细胞周期和PI-AnnexinV双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫印迹检测蛋白表达水平。结果 MTT结果表明白藜... 详细信息

目的探讨白藜芦醇诱导鼻咽癌CNE-1细胞凋亡及其分子机制。方法噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力;活细胞染色法(PI)流式细胞仪分析细胞周期和PI-AnnexinV双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫印迹检测蛋白表达水平。结果 MTT结果表明白藜芦醇呈浓度和时间依赖性抑制鼻咽癌CNE-1细胞活力,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);PI单染流式细胞仪分析表明白藜芦醇引起S期的CNE-1比例明显增多,相应免疫印迹结果显示细胞周期蛋白Cyclin E和Cyclin A显著下调,呈药物浓度依赖;PI-Annexin V双染流式细胞仪分析表明白藜芦醇呈药物浓度依赖诱导CNE-1细胞凋亡;免疫印迹分析显示抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,而促凋亡蛋白Bax表达上调。结论白藜芦醇能抑制鼻咽癌CNE-1细胞的增殖,使其阻滞在S期,并可能通过线粒体介导的凋亡通路诱导其凋亡。

关键词：白藜芦醇鼻咽癌细胞周期细胞凋亡