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侵染西番莲的夜来香花叶病毒的分子鉴定及特异性检测

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中国农业科学 2017年第24期50卷 4725-4734页

作者：谢丽雪张小艳郑姗张立杰李韬福建省农业科学院果树研究所

【目的】鉴定福建果园西番莲上的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,Te MV),并建立用于该病毒特异性检测的分子快速检测方法,为该病毒的防治提供参考依据。【方法】采用血清学检测、电镜观察、通用简并引物RT-PCR、特异性引物RT-PCR... 详细信息

【目的】鉴定福建果园西番莲上的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,Te MV),并建立用于该病毒特异性检测的分子快速检测方法,为该病毒的防治提供参考依据。【方法】采用血清学检测、电镜观察、通用简并引物RT-PCR、特异性引物RT-PCR对福建西番莲样品进行病毒检测,并对阳性样品的PCR产物进行克隆、测序;根据已报道的夜来香花叶病毒基因序列和本研究的序列测定结果,设计一对用于扩增Te MV外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长的特异性引物,通过反应条件优化,建立该病毒的特异性RT-PCR检测方法;序列测定结果利用BLAST程序和DNAMAN软件进行比对,同时对获得的CP基因序列采用Mr Bayes软件的贝叶斯法(Bayesian inference,BI)构建系统发育树并进行系统发育分析。【结果】血清学检测发现,一株表现有花叶、皱缩症状的西番莲样品与马铃薯Y病毒属(Potyvirus)通用抗体反应呈阳性;电镜观察结果表明,该株疑似带毒样品中含有大小约750 nm×12 nm的弯曲线状病毒粒子;Potyvirus通用简并引物RT-PCR从该样品中扩增到一条与预期大小相符的目的片段,克隆、测序获得长度为680 bp的序列,该序列与已报道的Te MV核苷酸序列一致性最高(98.2%)。特异性引物扩增获得的CP基因序列全长为816 bp(命名为BXGFJ-13分离物),与已报道的Te MV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分别为86.2%—98.4%和88.2%—97.8%。系统发育分析结果表明,13个Te MV分离物共形成3个类群,相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇,表现出很强的地理和寄主特异性。本研究获得的BXGFJ-13分离物与中国广西分离物(KJ789129)先以较高的后验概率聚为一个分支,再与泰国2个分离物(AM409188、AM409187)聚为第2类群(Group II),表明其在系统发育关系上与中国广西分离物的亲缘关系最近。利用特异性引物Te MV-CPf/Te MV-CPr建立的RT-PCR方法,具有良好的特异性,仅能从感染Te MV的西番莲样品上扩增出目的片段,而从黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、甜菜花叶病毒(Beet mosaic virus,Bt MV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)、洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)、东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)等其他病毒样品及阴性对照上均未扩增出目的片段。灵敏度测定结果显示,该方法能从稀释102倍的RNA上扩增出目的片段。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyvirus病毒不同成员的分类标准,同时结合血清学检测、电镜观察结果,证实福建果园表现花叶、皱缩症状的西番莲上携带有Te MV;建立的特异性RT-PCR方法能够用于Te MV的快速检测。

关键词：西番莲夜来香花叶病毒分子鉴定检测

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福建西番莲上首次检出东亚西番莲病毒

园艺学报 2018年第8期45卷 1587-1594页

作者：谢丽雪张立杰张小艳郑姗李韬福建省农业科学院果树研究所福州350013

为明确东亚西番莲病毒(East Asian passiflora virus,EAPV)在福建西番莲上的发生情况,采用血清学和RT-PCR检测技术对采集的西番莲病样进行检测,并对阳性样品PCR产物进一步克隆、测序和序列分析。结果表明,11份样品的马铃薯Y病毒属(Potyv... 详细信息

为明确东亚西番莲病毒(East Asian passiflora virus,EAPV)在福建西番莲上的发生情况,采用血清学和RT-PCR检测技术对采集的西番莲病样进行检测,并对阳性样品PCR产物进一步克隆、测序和序列分析。结果表明,11份样品的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒血清学检测结果为阳性,大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)血清学检测结果均为阴性;应用Potyvirus属通用引物从11份样品中扩增得到预期大小约660 bp的目的片段,序列比对发现,其中10份阳性样品与已报道的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,TeMV)核苷酸序列高度一致,1份样品与已报道的EAPV核苷酸序列一致性超过98.3%。针对EAPV疑似样品(命名为FJBXG-P1),利用特异性引物扩增得到预期大小约955 bp的目的片段,获得的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列全长870 bp(Gen Bank登录号:MG650164)。序列比对发现,EAPV分离物FJBXG-P1的CP基因序列与已报道的EAPV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分别为81.0%~97.6%和84.0%~96.9%;系统发育分析结果表明,38个EAPV分离物在系统发育关系上聚为两簇(GroupⅠ和GroupⅡ),其中GroupⅠ为AO株系,GroupⅡ为IB株系,FJBXG-P1分离物属于AO株系。福建西番莲上EPAV的检出,是该病毒在中国大陆地区发生的首次报道。

关键词：西番莲东亚西番莲病毒分子鉴定

侵染西番莲的东亚西番莲病毒全基因组序列特征及TC-RT-PCR检测技术

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中国农业科学 2022年第22期55卷 4408-4418页

作者：谢丽雪张小艳张立杰郑姗李韬福建省农业科学院果树研究所

【目的】东亚西番莲病毒（East Asian Passiflora virus,EAPV）是西番莲（百香果）上危害严重的一种病毒。本研究对我国大陆地区东亚西番莲病毒福建分离物（EAPV-FJ）的全基因组序列进行测定，明确其基因组序列特征，并建立适用于EAPV... 详细信息

【目的】东亚西番莲病毒（East Asian Passiflora virus,EAPV）是西番莲（百香果）上危害严重的一种病毒。本研究对我国大陆地区东亚西番莲病毒福建分离物（EAPV-FJ）的全基因组序列进行测定，明确其基因组序列特征，并建立适用于EAPV特异性检测的TC-RT-PCR(tube capture RT-PCR)技术，旨在为该病毒的检测、监测及防治提供理论依据和技术支持。【方法】采用小RNA深度测序技术结合分段克隆方法和RACE技术，测定EAPV-FJ的全基因组序列，对获得的序列进行序列特征、系统发育关系和重组分析；通过反应条件及反应体系优化，建立用于EAPV快速检测的TC-RT-PCR技术，测定其特异性和灵敏度，并应用建立的TC-RT-PCR技术对福建省西番莲果园采集的样品进行检测，同时利用普通RT-PCR检测方法进行验证。【结果】测序获得的EAPV-FJ核苷酸序列全长为10 065 nt（不含polyA尾），含有一个长度为9 663 nt的开放阅读框，编码3 220 aa的多聚蛋白（polyprotein），经剪切后最终生成P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb和CP 10个蛋白。基因组序列一致性分析结果表明，EAPV-FJ全基因组与GenBank登录的4个EAPV代表分离物核苷酸序列一致性为80%—99%，其中与AO株系的越南分离物EAPV-GL1(GenBank登录号：MT450870)一致性最高，为99%;EAPV-FJ多聚蛋白核苷酸、氨基酸序列与GenBank登录的4个EAPV代表分离物一致性分别为79%—99%、82%—98%。基于多聚蛋白核苷酸序列的系统发育关系分析显示，EAPV分离物共分为两个类群（Group I为AO株系、GroupⅡ为IB株系），未表现出明显的地理相关性，其中EAPV-FJ属于Group I，与已报道的越南分离物EAPV-GL1亲缘关系最近。重组分析结果表明，EAPV-FJ为非重组分离物。建立的TC-RT-PCR检测技术具有较好的特异性和灵敏度，仅能检测到感染EAPV的西番莲样品，而黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）、西番莲潜隐病毒（Passiflora latent virus,PLV）、木槿潜隐皮尔斯堡病毒（hibiscus latent Fort Pierce virus,HLFPV）、芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus,TuMV）、大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV）、夜来香花叶病毒（telosma mosaic virus,TeMV）等其他病毒及健康样品均无法检测到；灵敏度最低可以检测到稀释10倍的EAPV西番莲病叶提取液原液，与普通RT-PCR检测方法的灵敏度相当。应用建立的TC-RT-PCR技术从福建省西番莲果园采集的60份疑似病样中检出EAPV共13份，该结果与普通RT-PCR检测结果一致。【结论】首次报道了我国大陆地区EAPV全基因组序列，该分离物（EAPV-FJ）基因组结构与已报道的其他分离物一致，在系统发育关系上与越南分离物EAPV-GL1亲缘关系最近，且未检测到重组位点；建立的TC-RT-PCR检测技术具有操作简便、特异性强、灵敏度高和成本低的优点，能有效用于西番莲果园样品上EAPV的实际检测。

关键词：西番莲东亚西番莲病毒全基因组 TC-RT-PCR检测

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信息化环境下古诗精准教学模式实践研究

试题与研究 2020年第24期 133-134页

作者：谢丽雪福建省龙岩初级中学

随着新课改的不断落实,培养学生的核心素养已经成为当前初中教育的一项重要内容,在初中的语文教学体系中,古诗教学是其中的重要内容之一,不同的学生学习能力和学习需求都是具有一定差异性的,而教学的精准程度则会直接影响核心素养的落... 详细信息

随着新课改的不断落实,培养学生的核心素养已经成为当前初中教育的一项重要内容,在初中的语文教学体系中,古诗教学是其中的重要内容之一,不同的学生学习能力和学习需求都是具有一定差异性的,而教学的精准程度则会直接影响核心素养的落实。在当前的核心素养视域下,初中语文精准教学仍然存在很多的问题,本文就此提出了相应的解决方法,希望能够为初中语文教育工作者提供一定的借鉴。

关键词：初中语文古诗精准教学信息化

以趣入境,走近诗意——初中语文古诗词教学策略探究

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教师 2023年第11期 21-23页

作者：谢丽雪福建省龙岩市新罗区龙岩初级中学福建龙岩364000

古诗词教学是初中语文教学的重要内容之一。以趣入境,走近诗意,是初中语文古诗词教学的关键。文章作者基于教学实践,提出古诗词教学能够提升学生的语文学习效果,培养其审美情趣,提升学生人文素养,并对以趣入境的内涵展开了分析。在此基... 详细信息

古诗词教学是初中语文教学的重要内容之一。以趣入境,走近诗意,是初中语文古诗词教学的关键。文章作者基于教学实践,提出古诗词教学能够提升学生的语文学习效果,培养其审美情趣,提升学生人文素养,并对以趣入境的内涵展开了分析。在此基础上,文章作者提出在初中语文古诗词教学中,教师可以以游戏让学生“入境”,增强教学趣味性;可以以典故让学生“入境”,激发学生学习兴趣;可以以情境让学生“入境”,丰富学生情感体验;可以以体系让学生“入境”,使学生将所学内容融会贯通,从而提升语文古诗词教学效果,为学生的长远发展打好基础。

关键词：初中语文古诗词教学以趣入境

不同材料套袋对“丽光”黄皮果实主要经济性状、品质和病虫害的影响

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热带作物学报 2015年第9期36卷 1557-1560页

作者：刘友接谢丽雪熊月明福建省农业科学院果树研究所福建福州350013

以优质无核黄皮良种‘丽光’为试材,分析7种材料套袋对黄皮果实的主要经济性状、内在品质及病虫害的影响。结果表明:双层报纸袋和牛皮纸袋能提高黄皮果实的坐果率和可食率,改善果皮颜色及其它主要经济性状;牛皮纸袋能降低黄皮果实的含酸... 详细信息

以优质无核黄皮良种‘丽光’为试材,分析7种材料套袋对黄皮果实的主要经济性状、内在品质及病虫害的影响。结果表明:双层报纸袋和牛皮纸袋能提高黄皮果实的坐果率和可食率,改善果皮颜色及其它主要经济性状;牛皮纸袋能降低黄皮果实的含酸量,提高氨基酸总量和水分含量,改善黄皮果实的内在品质;硫酸纸袋、双层报纸袋、白色纸袋、无纺布袋、牛皮纸袋大大降低了黄皮果实的裂果率、桔小实蝇、堆蜡粉蚧、煤烟病、日灼病、炭疽病等病虫害的发生,有效改善果实的外观品质。综合各种套袋对改善果实主要经济性状、品质和防病虫害的效果,‘丽光’黄皮生产宜用牛皮纸袋。

关键词：果实套袋 “丽光”黄皮经济性状品质病虫害

蓝莓休克病毒IC-RT-nested PCR检测技术

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中国农业科学 2016年第22期49卷 4366-4374页

作者：谢丽雪郑姗张立杰张小艳李韬福建省农业科学院果树研究所

【目的】蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)是蓝莓上主要病毒之一,侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于BlShV快速检测的IC-RT-nested PCR技术,为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据GenBank... 详细信息

【目的】蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)是蓝莓上主要病毒之一,侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于BlShV快速检测的IC-RT-nested PCR技术,为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据GenBank已报道的BlShV基因序列,设计一对外侧引物(BlShV-F/BlShV-R)和一对内侧引物(BlShV-1/BlShV-2),以感染BlShV的蓝莓病叶为材料,利用免疫IC-RT-PCR(免疫捕获RT-PCR)和nested PCR(巢式PCR)建立BlShV的IC-RT-nested PCR检测技术;分别以BlShV、蓝莓焦枯病毒(Blueberry scorch virus,BlScV)、蓝莓带化病毒(Blueberry shoestring virus,BSSV)、蓝莓叶斑驳病毒(Blueberry leaf mottle virus,BLMoV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)和健康蓝莓叶片为对象,测定该检测技术的特异性;将BlShV第1轮、第2轮PCR产物分别回收纯化后连接到pMD18-T载体,连接产物转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,进行测序和序列比对验证该检测技术的准确性;将感染BlShV的蓝莓病叶提取液用健康蓝莓叶片提取液进行10倍梯度稀释,测定该检测技术的灵敏度,并与DAS-ELISA方法相比较;利用建立的IC-RT-nested PCR对收集的中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品(53份)和进境美国蓝莓叶片(15份)进行实际检测,并对上述样品采用普通RT-PCR方法进行验证。【结果】建立的IC-RT-nested PCR方法成功从感染BlShV病叶提取液第1轮PCR扩增出约746 bp大小的目的片段,第2轮PCR扩增出约486 bp大小的目的片段,未从健康蓝莓叶片提取液和空白对照扩增出目的片段;特异性测定结果表明,IC-RT-nested PCR具有良好的特异性,仅从感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR分别扩增到目的片段,而从BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康蓝莓叶片提取液第1轮、第2轮均未扩增到相应的目的片段;序列分析结果显示,感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR产物的序列同预期大小完全一致,分别为746、486 bp,将获得的两轮PCR产物序列与GenBank数据库中的BlShV基因序列进行比对,结果显示第1轮、第2轮PCR产物的序列与已报道的BlShV核苷酸序列一致性均达99%,证实两轮PCR产物均为BlShV特异性产物,进一步验证了扩增结果的准确性;灵敏度测定结果表明,IC-RT-nested PCR的第1轮PCR能够检测到稀释102倍的BlShV病叶提取液,灵敏度与DAS-ELISA相当,经过第2轮PCR,灵敏度提高100倍,能够检测到稀释104倍的BlShV病叶提取液;蓝莓样品IC-RT-nested PCR测定结果显示,2份来自于美国的蓝莓叶片样品扩增出大小约486 bp的目的片段,BlShV检出率为13.3%,而中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品上均未扩增出相应的目的片段,未检测到BlShV,该检测结果与普通RT-PCR验证结果完全相符,表明建立的IC-RT-nested PCR能够用于蓝莓样品的实际检测。【结论】建立的IC-RT-nested PCR具有快速、特异、准确和灵敏的优点,适合于田间和进出境口岸蓝莓样品上BlShV的检测鉴定。

关键词：蓝莓休克病毒 IC-RT-nested PCR 检测

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福建省蓝莓病虫害调查

福建农业学报 2019年第3期34卷 338-343页

作者：张小艳郑姗谢丽雪张立杰李韬福建省农业科学院果树研究所

【目的】全面了解福建省蓝莓栽培中的病虫害发生及为害情况,为福建省蓝莓病虫害的有效防控提供参考依据。【方法】通过踏查和定期定点调查相结合的方法,于2016-2018年对福建省的4个蓝莓种植基地病虫害发生情况进行了系统调查。【结果】... 详细信息

【目的】全面了解福建省蓝莓栽培中的病虫害发生及为害情况,为福建省蓝莓病虫害的有效防控提供参考依据。【方法】通过踏查和定期定点调查相结合的方法,于2016-2018年对福建省的4个蓝莓种植基地病虫害发生情况进行了系统调查。【结果】福建省为害蓝莓的病虫害有23种,其中病害7种,包含2种生理性病害和5种侵染性病害,2种生理性病害分别是红叶病和黄叶病,5种侵染性病害分别是僵果病、枝枯病、炭疽病、灰霉病和休克病毒病,其中休克病毒病为我国新发病害;虫害16种,分属4个目11个科,分别为梨剑纹夜蛾、铜绿丽金龟、云尺蛾、日本龟蜡蚧、黄刺蛾、黑腹果蝇、斑翅果蝇、暗黑鳃金龟、舞毒蛾、桃蚜、盗毒蛾、斜纹夜蛾、扁刺蛾、星天牛、桃红茎天牛和越橘巢蛾;23种病虫害中仅枝枯病和果蝇中度发生,其余病虫害均轻度发生。【结论】福建省蓝莓病虫害为害水平整体较轻,未发现为害严重的病虫害,枝枯病和果蝇是目前的主要病虫害,应引起足够重视。根据2种主要病虫害的发生特点,提出相应的防治建议。

关键词：蓝莓病虫害调查福建

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福建省一种蓝莓枝枯病病原鉴定

福建农业学报 2023年第10期38卷 1214-1219页

作者：张小艳陈细红谢丽雪张立杰郑姗李韬福建省农业科学院果树研究所福建福州350013 福州海关技术中心福建福州350001

【目的】明确福建省三明地区蓝莓枝枯病的病原菌,为该病害的有效防治提供理论依据。【方法】采集受害蓝莓枝条样品,通过常规组织分离法进行病原菌分离纯化,采用针刺法进行致病性测定完成柯赫氏法则验证,利用形态学特征并联合分子生物学... 详细信息

【目的】明确福建省三明地区蓝莓枝枯病的病原菌,为该病害的有效防治提供理论依据。【方法】采集受害蓝莓枝条样品,通过常规组织分离法进行病原菌分离纯化,采用针刺法进行致病性测定完成柯赫氏法则验证,利用形态学特征并联合分子生物学,明确致病菌的分类地位。【结果】从病组织中分离获得菌株KW1-4,将其回接至健康蓝莓枝条后,接种部位出现干枯病斑,再次分离获得的菌株与接种菌株一致,表明该菌株是引起蓝莓枝枯病的病原菌。菌株KW1-4菌落圆形,白色至灰色,有2种类型分生孢子,α型分生孢子长椭圆形至梭形,具2个明显油球,(4.77~7.63)μm×(1.55~2.71)μm,β型分生孢子线形,无油球,(11.95~19.65)μm×(1.05~1.94)μm。采用ITS,TEF1-ɑ,β-tubulin3段基因联合构建系统发育树,供试菌株KW1-4与Diaporthe australiana聚在同一分支。对比形态学特征,确定菌株KW1-4为间座壳属真菌Diaporthe australiana。【结论】引起福建省三明市蓝莓枝枯病的病原菌是Diaporthe australiana,本研究首次报道Diaporthe australiana能够侵染蓝莓枝条。

关键词：蓝莓枝枯病间座壳菌鉴定