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作者：许泽仰昆明理工大学

学位级别：硕士

甲型副伤寒沙门氏菌(副甲菌)是革兰氏阴性菌,该菌广泛分布在自然界中,属于危害性极大的肠道致病菌。副甲菌会引起副伤寒病症,常出现的症状为腹痛、发烧以及脾脏肿大等,严重者可导致死亡。病原菌进入人体的第一道关卡就是先天性免疫,吞... 详细信息

甲型副伤寒沙门氏菌(副甲菌)是革兰氏阴性菌,该菌广泛分布在自然界中,属于危害性极大的肠道致病菌。副甲菌会引起副伤寒病症,常出现的症状为腹痛、发烧以及脾脏肿大等,严重者可导致死亡。病原菌进入人体的第一道关卡就是先天性免疫,吞噬细胞在先天免疫中发挥着举足轻重的作用,入侵的绝大多数病原菌都会被吞噬细胞杀灭,而副甲作为胞内寄生菌,能够在吞噬细胞内生存,并被吞噬细胞携带到人体其他部位进而传播开来,研究其中的机制有助于针对性的防控副甲的播散。NO是吞噬细胞杀灭内吞菌的重要武器,已有研究报道,鼠伤寒沙门氏菌与大肠杆菌细胞内的操纵子norRVW能够产生功能分子,分解吞噬细胞内的NO,而针对副甲菌的相关研究并未见报道,为此本研究拟针对norRVW与副甲致病性进行初步探索。本文依据副甲菌CMCC50973基因组(GI:CP009049)中norRVW操纵子内norT、norV、norW的序列,设计引物分别扩增其同源臂(R12、R34、V12、V34、W12、W34),融合PCR将相应的两个上下游同源臂进行融合,得到敲除同源融合臂(R14、V14、W14),TA克隆并鉴定正确后,Bgl Ⅱ酶切回收同源融合臂,与相同酶切的自杀性载体pYG4连接,转化至S17-1λpir。鉴定后的阳性菌株经接合转移将重组质粒转移到利福平抗性副甲菌50973(Rif+)中,进行对应基因的缺失突变,由此获得基因缺失突变菌:50973(△norR)、50973(△norV)以及50973(ΔnorW)。同时,扩增包括启动子与终止子在内的norR片段,与T载体pMD19T vector(simple)连接后转化至50973(Rif+)中,构建norR过表达菌50973(NorR)。为了研究norW、norW对副甲致病性的影响,将75只雌性BALB/c小鼠随机分为对照组 50973(Rif+)与四个实验组 50973(ΔnorR)、50973(△norV)、50973(ΔnorW)、50973(NorR),每组再随机分为三小组,每小组含小鼠5只,分别在小鼠腹腔内注射105、106、107的对应细菌,记录注射后72小时小鼠存活情况,比较不同菌株的致死力。由此计算出各菌株的 LD50:LD50/50973(Rif+)=1.25× 106,LD50/50973(ΔnorV)=1.99×106,LD50/50973(△norW)=1.99X 106,LD50/50973(ΔnorR)>3.16×107,LD50/50973(NorR)=1.77×105。结果表明:相对于 50973(Rif+)组,50973(ΔnorV)与 50973(ΔnorW)致死力略微减弱,50973(ΔnorR)致死力显著减弱,50973(NorR)致死力明显增强。从存活率最高组各取三只,测定小鼠脾脏中的单位菌量,比较不同菌株的生存力。各菌株经腹腔注射72 h后在脾脏中的存活量分别为:50973(Rif+)=1.89× 104±1.97× 104,50973(△norV)=1.08× 104±536.69,50973(△norW)=5.89×104± 5.27×104,50973(△norR)=0±0,50973(NorR)=5.03×103±2.31×103。结果表明:相对于 50973(Rif),50973(△norV)与 50973(△norW)生存力下降,50973(△norR)生存力几乎为 0,50973(NorR)生存力提高。为了研究norR、norV、norW之间的关系,于对数生长期分别提取前述五株菌的总RNA,以5SrRNA为内参,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定:50973(Rif+)、50973(△norV)、50973(ΔnorW)中 norR的转录水平;50973(Rif+)、50973(ΔnorR)、50973(NorR)中 norV转录水平;50973(Rif+)、50973(△norV)、50973(NorR)中 norW的转录水平,以2-ΔΔCt法进行相对定量分析。结果表明:1)norV与norW的缺失会引起norR转录水平增加,提示在副甲菌中,norV与norW的减少会反馈到细菌调节系统中,从而使细胞norR转录增强;2)norR的缺失会引起norV与norW转录水平的下降,而norR的过表达会引起与norV与norW转录水平的增加,提示在副甲菌中,norR正向调节norV与norW的转录。综上所述,本研究分别构建了 norR、norV、norW基因缺失突变菌和norR过表达菌;细菌的致死力与生存力的研究表明,操纵子norRVW能够影响细菌致病性,其中norR表现为甚;qRT-PCR结果提示,norR正调控norF、norW转录,后者对前者存在负反馈。这些初步研究结

关键词：甲型副伤寒沙门氏菌同源重组基因敲除实时荧光定量PCR

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宿主菌抗噬菌体机制的研究进展

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病毒学报 2015年第4期31卷 474-479页

作者：毛普加曾韦锟洪愉冯梦蝶许泽仰昆明理工大学医学院昆明650500 昆明学院医学院临床检验教研室昆明650214 成都军区昆明总医院核医学科昆明650032

噬菌体又称细菌病毒,是公认最丰富的微生物,也是最多样性的,这种多样性是适应所面对选择性压力例如普遍存在宿主菌的噬菌体抗性机制。噬菌体通过6步(吸附、注入、复制、转录翻译、组装和释放)侵入细菌并使之裂解,但是当噬菌体感染细菌,... 详细信息

噬菌体又称细菌病毒,是公认最丰富的微生物,也是最多样性的,这种多样性是适应所面对选择性压力例如普遍存在宿主菌的噬菌体抗性机制。噬菌体通过6步(吸附、注入、复制、转录翻译、组装和释放)侵入细菌并使之裂解,但是当噬菌体感染细菌,就会面临细菌抗噬菌体的机制,宿主菌能够进化出多种抗噬菌体的机制来避免噬菌体的侵染和裂解。本文就对宿主菌抗噬菌体各种机制作一综述。

关键词：宿主菌噬菌体抗性机制

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甲型副伤寒杆菌抗噬菌体及生物膜形成基因的筛选及鉴定

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生物化学与生物物理进展 2015年第6期42卷 583-588页

作者：毛普加冯梦蝶洪愉许泽仰赵继华杨洪文宋武战黄芬井申荣曾韦锟昆明理工大学医学院昆明650500 昆明学院医学院昆明650214 成都军区昆明总医院核医学科昆明650032

细菌生物膜(bacterial biofilm,BF)与大部分的细菌感染相关,有助于病原菌抵抗外部不利的环境,包括抗生素和抗噬菌体等.为了研究生物膜和抗噬菌体的作用机制,本文以6株抗噬菌体甲型副伤寒杆菌(副甲菌)突变菌作为研究对象,在Rif+(利福平)(... 详细信息

细菌生物膜(bacterial biofilm,BF)与大部分的细菌感染相关,有助于病原菌抵抗外部不利的环境,包括抗生素和抗噬菌体等.为了研究生物膜和抗噬菌体的作用机制,本文以6株抗噬菌体甲型副伤寒杆菌(副甲菌)突变菌作为研究对象,在Rif+(利福平)(200 mg/L)平板中划线并滴加噬菌体验证能否抗噬菌体,将6株突变菌接种于96孔板中,每组3个重复,观察其成膜能力以及生物膜的形态,定点突变和互补实验验证突变菌的噬菌体抗性是否由突变基因所引起.结果显示:划线平板中野生型副甲菌在滴加1.2×106个噬菌体处出现空缺,而6株突变菌在滴加2.4×109个噬菌体后仍能生长,表明6株突变菌具有抗噬菌体特性;6株突变菌中,σ-54依赖的翻译调节器突变菌成膜能力(A595=1.1±0.2)较野生型副甲菌(A595=0.5±0.1)显著性增强,且差异显著(P<0.05),光学显微镜下菌体聚集成粗大的不规则团块;同源重组敲除野生型副甲菌σ-54依赖的翻译调节器,突变菌出现噬菌体抗性,将表达σ-54依赖的翻译调节器的载体转化该突变菌,突变菌又恢复了噬菌体敏感性.结果表明,σ-54依赖的翻译调节器是抗噬菌体和生物膜形成相关的基因.

关键词：甲型副伤寒沙门菌转座抗噬菌体生物膜

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抗生物膜感染的群体效应抑制剂

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上海交通大学学报（医学版） 2016年第3期36卷 442-446页

作者：冯梦蝶洪愉毛普加许泽仰曾韦锟昆明理工大学基础医学院病原生物学与免疫学教研室昆明650500 成都军区昆明总医院核医学科昆明650032 昆明学院医学院临床检验教研室昆明650214

生物膜是微生物群落附着在基质或表面并被自身合成的胞外基质包裹形成的复合物。细菌生物膜为细菌提供保护层,阻止抗生素进入,使细菌表现出抗抗生素能力。据临床统计表明,80%病原菌感染与其群体效应(QS)介导的生物膜相关,因此,要根治病... 详细信息

生物膜是微生物群落附着在基质或表面并被自身合成的胞外基质包裹形成的复合物。细菌生物膜为细菌提供保护层,阻止抗生素进入,使细菌表现出抗抗生素能力。据临床统计表明,80%病原菌感染与其群体效应(QS)介导的生物膜相关,因此,要根治病原菌的感染,抑制生物膜的形成至关重要。QS分子参与生物膜形成,而QS抑制剂(QSI)能抑制生物膜形成。该文就QSI在抗生物膜方面的进展进行综述。

关键词：生物膜群体效应群体效应抑制剂

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呼吸道合胞病毒F1蛋白截短体(F_(212-489))的原核表达及纯化

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中国生物制品学杂志 2015年第1期28卷 35-38页

作者：冯梦蝶冯金洪愉许泽仰毛普加黄芬井申荣曾韦锟昆明理工大学医学院云南昆明650500 成都军区昆明总医院核医学科云南昆明650032 昆明学院医学院云南昆明650214

目的原核表达并纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白截短体(F212-489)。方法从质粒p MD-18T-f中PCR扩增截短f1基因(f212-489),经TA克隆测序正确后,将目的片段插入原核表达载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a... 详细信息

目的原核表达并纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白截短体(F212-489)。方法从质粒p MD-18T-f中PCR扩增截短f1基因(f212-489),经TA克隆测序正确后,将目的片段插入原核表达载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-f212-489,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒p ET-28a-f212-489经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;纯化的重组蛋白纯度为85%,可与羊抗RSV多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了RSV F1蛋白截短体(F212-489),纯化的重组蛋白反应原性良好,为更好地研究RSV的免疫机理及通过基因工程方法研制特定部位的亚单位或多肽疫苗奠定了基础。

关键词：呼吸道合胞病毒 F蛋白截短蛋白原核细胞基因表达纯化

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抗噬菌体甲型副伤寒沙门菌突变菌的构建及其生物学特性

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吉林大学学报（医学版） 2015年第2期41卷 275-281页

作者：毛普加冯梦蝶洪愉毛小萍许泽仰赵继华杨洪文宋武战黄芬井申荣曾韦锟昆明理工大学医学院病原微生物学实验室云南昆明650500 昆明学院医学院临床检验教研室云南昆明650214 成都军区昆明总医院核医学科云南昆明650032 湖北省孝感市中心医院泌尿外科湖北孝感432000

目的:采用同源重组基因敲除方法构建3株甲型副伤寒沙门菌(副甲)抗噬菌体突变菌,并研究其生物学特性。方法:通过PCR和融合PCR方法获得了2、3、5号同源臂片段,经酶切后与pYG4载体连接,构建pYG4-2、pYG4-3和pYG4-5同源重组质粒。经PCR测序... 详细信息

目的:采用同源重组基因敲除方法构建3株甲型副伤寒沙门菌(副甲)抗噬菌体突变菌,并研究其生物学特性。方法:通过PCR和融合PCR方法获得了2、3、5号同源臂片段,经酶切后与pYG4载体连接,构建pYG4-2、pYG4-3和pYG4-5同源重组质粒。经PCR测序鉴定正确后,与野生型副甲菌进行同源重组,获得2、3、5号3株抗噬菌体突变菌。将3株突变菌和野生型副甲菌经不同种类和浓度的抗生素、不同pH值和温度及不同浓度的盐离子处理后,测量菌株的A595值,分析3株突变菌对抗生素、温度、pH值和盐离子的敏感性以及生长曲线。结果:PCR和融合PCR扩增出3个同源臂,构建的pYG4-2、pYG4-3和pYG4-5同源重组质粒经PCR测序表明构建成功;同源重组和抗噬菌体验证表明成功获得3株抗噬菌体突变菌。3株突变菌产生了卡那霉素抗性,且对链霉素表现出敏感性;2号菌表现出氨苄青霉素抗性,5号菌表现高温度耐受性;与野性型副甲菌比较,3株突变菌的生长曲线明显平缓,尤以2号突变菌最为突出。结论:成功构建抗噬菌体突变菌,并获得一些特殊的生物学特性。

关键词：甲型副伤寒沙门菌突变菌同源重组生物学特性噬菌体抗性

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LSPA1早期基因gp22细菌双杂交诱饵载体与筛选文库的建立

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生物技术通报 2015年第7期31卷 214-219页

作者：冯梦蝶毛普加洪愉许泽仰赵继华杨洪文宋武战黄芬井申荣曾韦锟昆明理工大学医学院昆明650500 成都军区昆明总医院核医学科昆明650032 昆明学院医学院临床检验教研室昆明650214

构建细菌双杂交系统中的诱饵载体p KT25-gp22和甲型副伤寒沙门氏菌基因文库以便后续的筛选实验。PCR扩增获得gp22基因,插入p KT25构成诱饵质粒p KT25-gp22。提取甲型副伤寒沙门氏菌基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到p UT18C质粒的Ba... 详细信息

构建细菌双杂交系统中的诱饵载体p KT25-gp22和甲型副伤寒沙门氏菌基因文库以便后续的筛选实验。PCR扩增获得gp22基因,插入p KT25构成诱饵质粒p KT25-gp22。提取甲型副伤寒沙门氏菌基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到p UT18C质粒的Bam HⅠ位点,获得基因组DNA表达文库。用化转的方法将诱饵质粒与p UT18C共转入BTH101,检测诱饵质粒自激活作用,并检测诱饵蛋白对宿主菌的毒性。将文库质粒电转至JM109感受态,PCR鉴定文库的多样性。诱饵载体p KT25-gp22无自激活报告基因的能力且对细菌的生长无毒性。所构建的副甲基因组文库覆盖基因组达8倍,满足文库筛选需要。成功构建细菌双杂交系统中诱饵载体p KT25-gp22,筛选文库质量良好,可应用于细菌双杂交实验。

关键词：细菌双杂交诱饵载体基因组文库早期基因甲型副伤寒沙门氏菌

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FQ-PCR与IMSA检测转基因豆奶外源基因的比较研究

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大豆科学 2018年第6期37卷 943-949,954页

作者：乐振窍许泽仰张细玲陈慧国祖新福建达利食品集团有限公司福建惠安362100 广州迪澳生物科技有限公司广东广州510507 甘肃省食品检验研究院甘肃兰州730030

为比较实时荧光定量PCR(FQ-PCR)与等温多自配引发扩增(IMSA)技术检测转基因豆奶中外源基因(CaMV35S、NOS、EPSPS)的灵敏度和特异性。合成CaMV35S、NOS以及EPSPS基因的质粒,通过FQ-PCR与IMSA检测定量的质粒,比较质粒灵敏度;按0. 50%、0. ... 详细信息

为比较实时荧光定量PCR(FQ-PCR)与等温多自配引发扩增(IMSA)技术检测转基因豆奶中外源基因(CaMV35S、NOS、EPSPS)的灵敏度和特异性。合成CaMV35S、NOS以及EPSPS基因的质粒,通过FQ-PCR与IMSA检测定量的质粒,比较质粒灵敏度;按0. 50%、0. 10%、0. 05%以及0. 01%的比例制作转基因豆奶,通过FQ-PCR与IMSA检测转基因大豆标准品制成的豆奶,比较样品灵敏度和特异性。结果表明:IMSA检测CaMV35S、NOS、EPSPS基因的质粒灵敏度分别为31. 01,31. 01,3. 10 cps·μL^(-1),FQ-PCR检测CaMV35S、NOS、EPSPS基因的质粒灵敏度皆为31. 01cps·μL^(-1); IMSA检测CaMV35S、NOS、EPSPS基因的样品灵敏度分别为0. 05%、0. 05%、0. 01%,FQ-PCR检测CaMV35S、NOS、EPSPS基因的样品灵敏度皆为0. 10%; FQ-PCR非特异性检出DP356043的NOS以及MON87701的CaMV35S与EPSPS。说明IMSA方法检测转基因豆奶外源基因(CaMV35S、NOS、EPSPS)的灵敏度与特异性优于FQ-PCR。

关键词： FQ-PCR IMSA 豆奶外源基因灵敏度特异性

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CAT为报告基因的铜绿假单胞菌启动子文库的建立及初步鉴定

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生命科学研究 2014年第6期18卷 521-526页

作者：冯梦蝶洪愉许泽仰毛普加冯金赵继华杨洪文宋武战黄芬井申荣曾韦锟昆明理工大学医学院中国云南昆明650500 成都军区昆明总医院核医学科中国云南昆明650032

以CAT（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）为报告基因,构建p CAT2启动子探针载体从绿脓杆菌基因文库中筛选启动子。Sau3AⅠ酶切铜绿假单胞菌的基因组,回收（500-1 500 bp）片段并与p CAT2载体连接构建铜绿假单胞菌的基因组文库,... 详细信息

以CAT（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）为报告基因,构建p CAT2启动子探针载体从绿脓杆菌基因文库中筛选启动子。Sau3AⅠ酶切铜绿假单胞菌的基因组,回收（500-1 500 bp）片段并与p CAT2载体连接构建铜绿假单胞菌的基因组文库,PCR鉴定文库的多样性,利用氯霉素（10μg/m L）和卡那霉素（50μg/m L）双抗平板筛选了16株阳性菌株,并用PCR、测序、NCBI比对进行鉴定。构建的基因文库的库容量可达50 000个,覆盖基因全长的3.5倍,插入率达90%,具有较强的随机性。采用双抗平板进行启动子的筛选,筛选效率高达96%。获得了绿脓杆菌基因组中的9个启动子,同源性达99%以上,并对其活性进行初步鉴定,为铜绿假单胞菌基因表达调控的进一步研究奠定基础。

关键词：氯霉素乙酰转移酶(CAT) 报告基因铜绿假单胞菌(PA) 启动子文库

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带锚定基序3LysM的EGFP融合蛋白与乳酸乳球菌的体外混合展示

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中国微生态学杂志 2014年第5期26卷 497-501,525页

作者：冯金洪愉毛普加冯梦蝶许泽仰黄芬井申荣曾韦锟昆明理工大学医学院云南昆明650500 成都军区昆明总医院核医学科云南昆明650032

目的探索融合有锚定序列的EGFP蛋白,能否通过体外混合展示于乳酸乳球菌MG1363表面。方法采用融合PCR方法扩增带有锚定序列的egfp(3LysM-egfp),亚克隆至pMD18T载体,测序正确后,插入表达载体pET28a转化BL21(DE3)进行诱导表达、纯化,将纯化... 详细信息

目的探索融合有锚定序列的EGFP蛋白,能否通过体外混合展示于乳酸乳球菌MG1363表面。方法采用融合PCR方法扩增带有锚定序列的egfp(3LysM-egfp),亚克隆至pMD18T载体,测序正确后,插入表达载体pET28a转化BL21(DE3)进行诱导表达、纯化,将纯化的3LysM-EGFP与乳酸乳球菌进行体外混合作用,荧光显微镜及Western-blot检测展示效果。结果成功构建表达重组菌pET28a-3LysM-egfp/BL21并诱导出可溶性3LysM-EGFP,纯化后蛋白纯度达到81.5%,荧光显微镜及Western-blot均检测到展示的目的蛋白。结论纯化后的3LysM-EGFP能在体外条件下展示在乳酸乳球菌表面。

关键词：锚定乳酸乳球菌纯化展示

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