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拟南芥RALF多肽家族的生物信息学初步分析及转基因植物的构建

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拟南芥RALF多肽家族的生物信息学初步分析及转基因植物的构建

作者：许奕晗湖南大学

学位级别：硕士

快速碱化因子（Rapid Alkalinization Factor,RALF）作为受体介导的信号载体在植物防御和发育的调节中起关键作用,是一类在植物界保守地、能抑制氢泵活性从而调控细胞伸长的重要多肽激素。植物在分类成单子叶植物和双子叶植物之前就存在... 详细信息

快速碱化因子（Rapid Alkalinization Factor,RALF）作为受体介导的信号载体在植物防御和发育的调节中起关键作用,是一类在植物界保守地、能抑制氢泵活性从而调控细胞伸长的重要多肽激素。植物在分类成单子叶植物和双子叶植物之前就存在RALF蛋白家族,可能行使不同功能。拟南芥数据库中可检索到39种RALF基因,除了部分RALF功能和机制研究较为清楚之外,大部分的结构、和生物学功能并不清楚。为了比较不同RALF的生物学功能差异,本课题首先拟通过生物信息学的方法对拟南芥不同RALF的理化性质、蛋白结构进行初步分析。然后构建RALF基因的过表达载体,建立拟南芥缺失突变体和过表达转基因植株材料,观察拟南芥突变体的表型,研究拟南芥不同RALF基因的功能。通过本论文的研究,我们得到主要实验结果如下:（1）对拟南芥RALF家族的理化性质进行了预测的归纳分析。结果显示大多数拟南芥RALF蛋白的分子量、亲水性、正/负电荷残基数、p I值、不稳定系数、脂肪系数等理化性质较为相似,但RALF23和RALF34具有较大的相对分子质量。除了AT2G32788蛋白为疏水性蛋白,其余的38种RALF蛋白皆为亲水性蛋白,有27个蛋白质属于不稳定蛋白质,AT2G32788、RALF14、RALF25具有较大的脂肪指数,表明RALF家族在具有诱导植物组织间碱化的功能同时,某些蛋白还具有独特的生理生化功能。（2）对拟南芥RALF家族的序列相似性和亲缘关系进行了分析。结果显示利用系统发育树将拟南芥RALF家族的39个成员分成6类,基因点阵图检验结果显示该分类与功能密切相关,保守基序分析分析显示motif 1和motif 2在6类RALF中均保守,Logo分析表明半胱氨酸在维系RALF生物功能中可能发挥着重要的作用,Signal P 4.1分析显示90%的RALF蛋白均存在信号肽。（3）拟南芥RALF基因T-DNA插入突变体的鉴定和部分RALF过表达植株的构建和鉴定。对从ABRC网站上购买拟南芥328株插入突变体进行3引物法鉴定,获得ralf1、ralf3、ralf4、ralf6、ralf7、ralf12、ralf17、ralf20、ralf21、ralf23、ralf27、ralf30和ralf33等13种纯合突变体,定量PCR结果显示纯合体种13种RALF表达量分别显著降低。构建并获得了RALF1-OE、RALF6-OE、RALF7-OE、RALF17-OE、RALF20-OE、RALF23-OE、RALF31-OE、RALF33-OE等8种过表达植株（每种植株都有2种以上的株系）,定量PCR结果显示相应RALF的表达量均显著增加。（4）拟南芥部分ralf缺失突变体表型的初步分析。对鉴定到的13种纯合突变体的表型进行了初步分析,结果显示ralf1、ralf23和ralf33缺失突变体中根毛减少,根长变长并提前抽苔;拟南芥ralf17缺失突变体的莲座叶叶片小,植株矮小,生长缓慢;除ralf17外,其他12种突变体种WRKY53、PDF1.2和FRK1等抗逆标记基的因表达量均有不同程度地上调。根部接种内生真菌后,拟南芥ralf1和ralf33缺失突变体的真菌量都有不同程度的减少。利用RALF1处理野生型拟南芥会导致RALF1、RALF31的基因表达显著下调。综上所述,39种拟南芥RALF基因家族虽然大都具有相类似的理化特性和相近的亲缘关系,但是不同RALF基因发挥不同功能,某些RALF基因调控植物细胞发育和生长,某些RALF基因调控植物免疫与抗逆,RALF基因不同程度地影响植物表型和植株抗胁迫的能力。并且,不同RALF基因表达之间也存在联系。

关键词：拟南芥快速碱化因子肽信号转导配体

单一肠内营养治疗结肠型与非结肠型克罗恩病患者疗效差异的分析

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单一肠内营养治疗结肠型与非结肠型克罗恩病患者疗效差异的分析

作者：许奕晗南京医科大学

学位级别：硕士

背景:克罗恩病(Crohn’s disease,CD)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病,其并发症多、致残率高,因此CD的治疗在全世界范围内受到越来越广泛的关注。肠内营养(enteral nutrition,EN)除了能够改善CD患者营养状况以外,其诱导CD缓解的治疗... 详细信息

背景:克罗恩病(Crohn’s disease,CD)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病,其并发症多、致残率高,因此CD的治疗在全世界范围内受到越来越广泛的关注。肠内营养(enteral nutrition,EN)除了能够改善CD患者营养状况以外,其诱导CD缓解的治疗作用也得到了越来越广泛的认可。上个世纪90年代开始,EN在儿童CD治疗中的地位得到确认,大量文献已经证实,应用单一肠内营养(exclusive enteral nutrition,EEN)治疗即可诱导儿童活动期CD的缓解,同时肠内营养还可以加快肠道粘膜愈合,促进儿童的生长发育,改善其生活质量。因此,EEN已经被欧洲一些国家以及日本推荐作为儿童/青少年CD的一线治疗方案。但是,EEN在成人活动期CD的诱导缓解方面各研究报道不一,结果存在争议,尚未达成共识。特别是在成年人结肠型CD患者中,有研究报道其诱导缓解有效率在50%左右,远不如在非结肠型成人CD患者中有效。因此,寻找影响成人结肠型CD患者接受EEN治疗疗效差异的危险因素在指导EEN在成人CD患者中的应用有着重要意义。目的:本研究旨在寻找影响EEN诱导成人结肠型与非结肠型CD患者疾病缓解效果的危险因素,为EEN在成人结肠型CD中的应用提供指导。方法:回顾性收集2014年1月1日至2017年5月31日间在中国人民解放军东部战区总医院普通外科IBD治疗中心以EEN作为一线治疗方案的成人CD患者的临床资料。将符合入选标准的CD患者按照病变累及部位分为结肠型CD组与非结肠型CD组。主要观察指标是两组患者使用EEN后的临床缓解率,次要观察指标是血清炎症指标及营养指标的改善情况。使用单因素及多因素logistic回归分析来探究影响EEN诱导缓解效果的危险因素;结果:本项研究总共纳入241名处于疾病活动期的成人CD患者,其中结肠型CD组52名,非结肠型CD组189名。所有患者使用EEN时间均超过2周,EEN使用期间患者停用任何其他药物治疗。经过EEN诱导缓解治疗后结肠型CD组患者的临床缓解率明显低于非结肠型CD组患者(51.9%VS.68.3%,p=0.029)。在获得临床缓解的患者中,其血清C-反应蛋白(CRP)及Harvey Bradshaw index(HBI)评分(评价CD疾病活动度的评分工具)在EEN治疗后均明显改善(CRP(治疗前46.8±39.5 mg/L VS.治疗后6.09±2.7 mg/L);HBI(治疗前6.75±1.67 VS.治疗后2.97±0.9);均p<0.01)。单因素回归分析显示,单纯结肠病变、低BMI、病程长、肛周病变、治疗前CRP水平以及治疗前瘦肉体指数是EEN诱导缓解疾病活动期CD患者效果不佳的危险因素,多因素回归分析结果显示单纯结肠病变(OR=2.74,95%CI:1.2-6.23,p=0.016)、治疗前CRP水平(OR=1.01,95%CI:1.003-1.017,p=0.008)、治疗前低瘦肉体指数(OR=0.636,95%CI:0.444-0.912,p=0.014)是EEN诱导缓解治疗失败的独立危险因素。同时将结肠型患者与非结肠型患者按照年龄、性别、病程时间等相关条件进行1:1匹配后的倾向得分匹配模型验证了上述独立危险因素的存在。最后,本项研究对所有结肠型CD患者进行亚组分析时发现,全结肠病变(OR=16.7;95%CI=[1.074-260.5],p=0.044)是结肠型CD患者接受EEN治疗效果不佳的另一独立危险因素。结论:本项研究结果证实EEN在治疗成人活动期结肠型CD患者与非结肠型CD患者中疗效存在差异。与非结肠型CD患者相比,成人结肠型CD患者对EEN应答率更低,单纯结肠病变(尤其是全结肠病变)、治疗前CRP水平、治疗前低瘦肉体指数是EEN诱导缓解治疗失败的独立危险因素。

关键词：肠内营养结肠型克罗恩病非结肠型克罗恩病

基于PCA分析食用酒精微量成分对醋酸发酵的影响

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食品与发酵工业 2019年第11期45卷 123-128页

作者：许奕晗龙春花于峰廖红东湖南大学生物学院

醋酸发酵中,原料食用酒精的选择会影响发酵速率的快慢和发酵结果的成败。因此,为醋酸发酵建立一套醋酸发酵类食用酒精检测标准迫在眉睫。该实验采用气相色谱-质谱联用结合主成分法测定、分析来源不同的食用酒精的微量成分的差异。结果表... 详细信息

醋酸发酵中,原料食用酒精的选择会影响发酵速率的快慢和发酵结果的成败。因此,为醋酸发酵建立一套醋酸发酵类食用酒精检测标准迫在眉睫。该实验采用气相色谱-质谱联用结合主成分法测定、分析来源不同的食用酒精的微量成分的差异。结果表明,8种不同来源的食用酒精对醋酸的生产存在明显差异,采用气相色谱-质谱联用仪在这8种食用酒精中共检测出24种微量成分。PCA和聚类分析显示食用酒精中的微量成分的差异影响醋酸发酵的速率。甲酸、甲酸乙酯、戊酸-1,2-烯丙基酯、亚硫酸己基辛酯、草酸、丁基-6-乙基-3-酯、乙酸、甘油等微量成分可能影响醋酸发酵。发酵实验证实含量为100μg/mL的甲酸和含量为500μg/mL甲酸乙酯能显著降低醋酸发酵的速率。该研究表明食用酒精的微量成分影响醋酸发酵,并为建立一套以部分微量成分为参考值的醋酸发酵类食用酒精检测标准提供参考。

关键词：醋酸发酵主成分分析气相色谱-质谱联用仪微量成分

黏附性侵袭性大肠杆菌的致病机制及其在克罗恩病中的作用

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中华炎性肠病杂志（中英文） 2020年第4期4卷 333-336页

作者：许奕晗郭振朱维铭南京大学医学院附属金陵医院(东部战区总医院)普通外科炎症性肠病治疗中心南京210002

肠道微生物群失衡在克罗恩病(CD)发病中扮演着重要角色,尚未发现CD的单一致病微生物,一种特异性定植于CD患者末端回肠黏膜并能侵入肠上皮细胞和巨噬细胞的黏附性侵袭性大肠杆菌被认为与CD的发病密切相关。对黏附性侵袭性大肠杆菌特殊的... 详细信息

肠道微生物群失衡在克罗恩病(CD)发病中扮演着重要角色,尚未发现CD的单一致病微生物,一种特异性定植于CD患者末端回肠黏膜并能侵入肠上皮细胞和巨噬细胞的黏附性侵袭性大肠杆菌被认为与CD的发病密切相关。对黏附性侵袭性大肠杆菌特殊的生物学特性的深入研究可能有助于进一步了解CD的发病机制。

关键词：克罗恩病肠道微生态黏附性侵袭性大肠杆菌

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肠系膜脂肪在克罗恩病中的作用

中华炎性肠病杂志（中英文） 2017年第3期1卷 186-188页

作者：许奕晗朱维铭李毅郭振南京军区南京总医院普通外科南京大学医学院金陵医院普通外科 210002

1932年Crohn等[1]首次报道克罗恩病(Crohn's disease,CD)时就发现病变肠段存在一种肥厚的肠系膜脂肪组织(mesenteric adipose tissue,MAT),这种脂肪组织包裹炎症肠管周长的一半以上,故亦称为“匍行脂肪”(creeping fat).20世纪90年代,... 详细信息

1932年Crohn等[1]首次报道克罗恩病(Crohn's disease,CD)时就发现病变肠段存在一种肥厚的肠系膜脂肪组织(mesenteric adipose tissue,MAT),这种脂肪组织包裹炎症肠管周长的一半以上,故亦称为“匍行脂肪”(creeping fat).20世纪90年代,研究者们发现了肠系膜脂肪组织拥有免疫和内分泌功能,如今,肠系膜作为一个独立的器官,其功能及在疾病中的作用再次成为研究的热点[2].有研究显示MAT形态和功能的异常与克罗恩病的发生发展息息相关[3].因此,本文就克罗恩病中MAT的形态学特点、形成机制及其临床意义等进行详细综述.

关键词：研究功能脂肪组织肠段脂肪特点肠系膜

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浅谈日本文学

青年文学家 2018年第8期 116-117+119页

作者：许奕晗中国海洋大学

中日两国的交流可谓是历史悠久,源远流长。在经济、政治、文化等各个方面日本都曾效仿过中国。在频繁的文化碰撞中,文学也不可避免地被中国文学所影响。随着中国书籍在日本的广泛传播,中国古代的文学思想一直潜移默化地影响着日本文学... 详细信息

中日两国的交流可谓是历史悠久,源远流长。在经济、政治、文化等各个方面日本都曾效仿过中国。在频繁的文化碰撞中,文学也不可避免地被中国文学所影响。随着中国书籍在日本的广泛传播,中国古代的文学思想一直潜移默化地影响着日本文学。然而,日本在善于吸收借鉴他国文化的同时,自己也会结合本国的文化,民族特性,发展出合适本国人民的独特的日本文学。在与中国文学特点进行对比的同时,阐述了日本文学在去政治化、女流文化、物哀论三方面的民族特色,使我们更好地了解日本文学的特点。

关键词：日本文学去政治化女流文化物哀论

围手术期处理进展——ERAS、围手术期外科之家与围手术期医学

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中国实用外科杂志 2019年第2期39卷 118-121页

作者：朱维铭许奕晗黎介寿中国人民解放军东部战区总医院(原南京军区总医院)普通外科江苏南京210002 南京医科大学金陵临床医学院江苏南京210002

手术在外科疾病的治疗中具有举足轻重的作用,也由此推动了以手术为核心的加速康复外科(ERAS)的兴起与发展。但是随着理念的更新与技术的进步,临床医生逐渐认识到疾病治疗的重点不仅在于手术本身,术前、术后的处理也同样重要,以病人为主... 详细信息

手术在外科疾病的治疗中具有举足轻重的作用,也由此推动了以手术为核心的加速康复外科(ERAS)的兴起与发展。但是随着理念的更新与技术的进步,临床医生逐渐认识到疾病治疗的重点不仅在于手术本身,术前、术后的处理也同样重要,以病人为主体的围手术期处理与疾病的预后息息相关。因此,"围手术期医学"、"围手术期外科之家"等强调术前、术中、术后3个阶段整体治疗,涵盖整个疾病治疗过程的新兴治疗理念受到越来越多地关注。

关键词：围手术期医学加速康复外科围手术期外科之家预康复

儿童/青少年克罗恩病治疗:肠内营养还是生物制剂?

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中华炎性肠病杂志（中英文） 2018年第3期2卷 237-240页

作者：许奕晗李毅王新颖南京医科大学附属金陵医院普通外科 210093 南京军区南京总医院普外科炎症性肠病治疗中心 210002 南方医科大学珠江医院消化内科广州510280

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病,包括克罗恩病(Crohn's disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC).IBD尤其是CD患者发病年龄小,青少年是高发人群.文献报道儿童CD的发病率为2.5/10万～11.4/10万,患病率约为58/10万[1].儿童/青少年IBD还存在特殊性,与成人相比,其病变范围更为广泛,病情更严重,更需用免疫抑制剂治疗,而且,由于其处于生长发育期,疾病或用药可能导致生长发育迟缓[2].因此,缓解儿童/青少年的肠道炎症反应只是疾病治疗的目的之一,更重要的是要帮助这个特殊的IBD群体提高生活质量,保持生长发育的营养需求以及达到追赶性生长,使其能顺利重返社会,重获社会功能.

关键词：

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道路沥青紫外老化及抗老化材料研究综述

材料导报 2024年第1期38卷 44-56页

作者：孔令云席晗重庆交通大学土木工程学院重庆400074 重庆交通大学交通土建工程材料国家地方联合工程实验室重庆400074

道路沥青材料在使用过程中由于长期受到太阳光紫外辐射作用会产生紫外老化现象,并且这种现象在紫外辐射强度高的地区更明显。紫外老化会使沥青的物理特性和化学组成发生改变,从而导致沥青黏塑性上升、低温和疲劳性能下降、使用裂缝增加... 详细信息

道路沥青材料在使用过程中由于长期受到太阳光紫外辐射作用会产生紫外老化现象,并且这种现象在紫外辐射强度高的地区更明显。紫外老化会使沥青的物理特性和化学组成发生改变,从而导致沥青黏塑性上升、低温和疲劳性能下降、使用裂缝增加,进而劣化路面的耐久性、影响沥青路面的运营品质和服役寿命。为了防止和延缓紫外老化的产生和发展,可在道路沥青中添加抗老化材料以增强其抵御紫外老化能力,同时延长沥青路面的使用寿命并降低其性能的衰变速率。本文阐述了基于自由基和胶体理论的紫外老化机理;从处理方式、光源与辐射强度选择等方面介绍了室内模拟老化试验条件;总结了紫外老化对沥青物理和流变性能、组分构成、微观形貌、特征峰和官能团等宏微观特性的影响;归纳了现行抗老化材料的优缺点和使用情况。分析表明后期可在老化机理深度、试验方法标准化、室外老化监测、微观数值模拟、抗紫外老化剂针对性和抑制紫外老化措施等方面开展进一步研究。

关键词：道路沥青紫外老化老化机理室内模拟老化沥青特性影响抗紫外老化材料