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小胶质细胞中不同启动子驱动外源基因表达效率比较

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首都师范大学学报(自然科学版) 2024年

作者：覃鸿妮谢钰珍张楠楠张庆硕吴凡苏州工业园区服务外包职业学院瑞诺元(苏州)生物科技有限公司江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学)

为了开发适用于腺相关病毒（AAV）载体的改造，并具备高度神经细胞组织特异性的启动子，以实现AAV基因治疗药物对神经系统的精准靶向。本研究将巨细胞病毒（CMV）、鸡β-肌动蛋白（CBA）和含有CMV与CBA的复合启动子（CBH）共3种强启动... 详细信息

为了开发适用于腺相关病毒（AAV）载体的改造，并具备高度神经细胞组织特异性的启动子，以实现AAV基因治疗药物对神经系统的精准靶向。本研究将巨细胞病毒（CMV）、鸡β-肌动蛋白（CBA）和含有CMV与CBA的复合启动子（CBH）共3种强启动子分别装入AAV病毒载体中，研究三者在小胶质细胞中驱动外源基因表达的能力。首先，体外合成CMV、CBH和CBA启动子序列；其次，装到pSCAAV-EGFP载体上，获得pLBA-EGFP、pLMV-EGFP和 pLBH-EGFP共3个驱动表达绿色荧光蛋白的真核表达载体；再次，经HB101感受态细胞转化后，将测序验证正确的重组质粒转染到小鼠小胶质（BV2）细胞中；最后，48 h后荧光显微镜观察细胞中增强绿色荧光蛋白（EGFP）的表达情况，流式细胞仪和聚合酶链式反应（PCR）法检测增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达效率。结果表明3种启动子均可在BV2细胞内驱动外源基因表达，但启动效率存在差异。pLMV-EGFP转染后的EGFP阳性细胞比例为4.92%，明显高于另外2种启动子的2.16%（pLBH-EGFP）和3.60%（pLBA-EGFP）。荧光定量PCR的结果与流式细胞仪检测结果一致，CMV对应的细胞中的EGFP表达量最高、CBA次之、CBH最低。因此，CMV启动子在AAV载体上对小胶质细胞的专一性更好，可作为优选启动子用于神经系统基因治疗新药的开发，同时该结果也可为后续探索更多毒性弱、成本低的AAV基因治疗药物提供参考。

关键词： CBH启动子 CBA启动子 CMV启动子小胶质细胞 EGFP

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

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山东理工大学学报（自然科学版） 2024年第2期38卷 67-72页

作者：谢钰珍覃鸿妮吴凡孙曙光孟丽君苏州工业园区服务外包职业学院生物科技学院江苏苏州215123 江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学) 江苏苏州215000 苏州东岭生物技术有限公司江苏苏州215123

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成... 详细信息

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明在PD-L1终止密码子前成功插入了GFP片段,细胞株构建成功。通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD-L1-GFP报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD-L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定了基础。

关键词： PD-L1 CRISPR/Cas9 报告基因 GFP

高职院校基于国际合作办学的学分互认机制研究——以生物类专业为例

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知识文库 2022年第4期 109-111页

作者：吴凡谢钰珍覃鸿妮江苏省苏州市苏州工业园区服务外包职业学院

随着经济全球化程度不断提升以及我国"一带一路"建设的持续推进,职业教育国际化成为当前职业教育发展的新趋势,高职院校纷纷开展各种形式、各种内容的国际合作,从对发达国家职业教育经验与做法的学习借鉴到对国际职业资格证书认证的引进...

随着经济全球化程度不断提升以及我国"一带一路"建设的持续推进,职业教育国际化成为当前职业教育发展的新趋势,高职院校纷纷开展各种形式、各种内容的国际合作,从对发达国家职业教育经验与做法的学习借鉴到对国际职业资格证书认证的引进,从教师培训到学生交流,目前更多的采取的是更加深入的合作方式——合作办学。高职院校的国际合作办学是指按照与所合作的国外院校签订的合作协议,来对本校所设置的专业和课程进行建设与管理,以及对学生进行联合培养。

关键词：

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基因工程技术课程思政教学设计与实践

学园 2023年第31期16卷 23-25页

作者：谢钰珍覃鸿妮吴凡苏州工业园区服务外包职业学院江苏苏州215123

基因工程技术作为现代生物技术的核心,能够为基因的结构和功能研究奠定基础。以生物类专业的专业核心课程基因工程技术为例,阐述课程思政教学整体设计思路及育人目标,从修订教学目标、丰富教学内容、创新教学方法、完善教学评价多个方... 详细信息

基因工程技术作为现代生物技术的核心,能够为基因的结构和功能研究奠定基础。以生物类专业的专业核心课程基因工程技术为例,阐述课程思政教学整体设计思路及育人目标,从修订教学目标、丰富教学内容、创新教学方法、完善教学评价多个方面提出对策,为生物医药类相关课程的课程思政教学设计与实施提供参考。

关键词：基因工程技术课程思政教学设计

CA-NHEJ系统对大肠杆菌链霉素耐药基因rpsL的编辑效率及其耐药性研究

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江苏农业科学 2023年第23期51卷 17-21页

作者：谢钰珍覃鸿妮吴凡胡杨晓然薛高旭赵雪张勇苏州工业园区服务外包职业学院江苏苏州215123 苏州工业园区德威联合书院江苏苏州215123 金唯智生物科技有限公司江苏苏州215123

以控制质粒拷贝数的pcnB基因与链霉素耐药性rpsL基因为靶标基因,研究CA-NHEJ系统对大肠杆菌的基因编辑效率,及rpsL相关基因与链霉素耐药性的关系。通过CA-NHEJ系统成功实现了对大肠杆菌MG1655的pcnB和rpsL基因编辑,其中,pcnB基因编辑效... 详细信息

以控制质粒拷贝数的pcnB基因与链霉素耐药性rpsL基因为靶标基因,研究CA-NHEJ系统对大肠杆菌的基因编辑效率,及rpsL相关基因与链霉素耐药性的关系。通过CA-NHEJ系统成功实现了对大肠杆菌MG1655的pcnB和rpsL基因编辑,其中,pcnB基因编辑效率达100%,rpsL基因仅有1个克隆缺失第22~24位3个氨基酸,其他4个克隆未编辑成功但具有链霉素抗性;进一步利用CA-HR系统敲除大肠杆菌MG1655的rpsL基因CCTGCGCTG序列(第22~24位氨基酸),编辑效率达100%,验证了CA-HR的高效性,抗性鉴定表明,该序列是影响链霉素抗性的关键序列,是一个未曾报道的新突变;对于未编辑成功但具有链霉素抗性的4个克隆进行基因测序及比对,找出了rhsC和gadB等6个可能与链霉素抗性相关的其他基因。

关键词： CA-NHEJ系统 CA-HR系统 rpsL基因耐药性

利用CRISPR/Cas9技术构建能克隆难度序列的Stbl2^(TM)菌株

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2022年第5期43卷 87-93,100页

作者：覃鸿妮谢亦潇汤淑伟薛高旭谢悦张勇苏州工业园区服务外包职业学院生物科技学院江苏苏州215123 金唯智生物科技有限公司江苏苏州215123 瑞特佰生物科技有限公司江苏苏州215123

Stbl2^(TM)菌株适合克隆不稳定的外源DNA片段,但该菌株易受噬菌体侵染,且在构建某些高拷贝质粒时,难以克隆成功。利用CRISPR/Cas9技术将Stbl2^(TM)菌株的抗噬菌体相关基因fhuA和控制拷贝数的基因pcnB进行编辑,降低克隆难度,提高克隆效... 详细信息

Stbl2^(TM)菌株适合克隆不稳定的外源DNA片段,但该菌株易受噬菌体侵染,且在构建某些高拷贝质粒时,难以克隆成功。利用CRISPR/Cas9技术将Stbl2^(TM)菌株的抗噬菌体相关基因fhuA和控制拷贝数的基因pcnB进行编辑,降低克隆难度,提高克隆效率。针对2个基因分别设计sgRNA,构建含有sgRNA的质粒pTarget-fhuA和pTarget-pcnB,分别将2个质粒与pCas9-Red质粒转入Stbl2^(TM)菌株中,经菌落PCR和测序验证基因正确编辑后再将2个外源质粒消除,并将2 kb的线粒体基因组序列作为外源基因,转入菌株进行最终的功能验证。结果表明:fhuA基因被成功敲除103 bp,pcnB基因被成功敲除802 bp,将高拷贝pUC57质粒转入基因编辑后的Stbl2^(TM)菌株,可明显降低质粒的拷贝数,且能正确克隆线粒体基因难度序列。该研究构建的菌株可作为后续克隆难度序列的感受态使用,还可为难度序列的基因克隆提供借鉴方法。

关键词： CRISPR/Cas9技术 Stbl2^(TM)菌株 fhuA基因 pcnB基因

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职业教育规划教材基因工程操作基础

职业教育规划教材基因工程操作基础

校企协同背景下高职院校基因工程技术课程改革探索与实践

丛书名：职业教育规划教材

2019年

作者：覃鸿妮谢钰珍吴凡

本书是一本校企合作教材，以企业真实项目为蓝本，主要内容包括大肠杆菌的培养，DNA和RNA的提取和检测，利用聚合酶链式反应（PCR）获取目的基因，目的基因的克隆、转化与表达，基因的定点突变，cDNA文库和高通量测序（NGS）文库的构建... 详细信息

ISBN: (纸本)9787567225510

本书是一本校企合作教材，以企业真实项目为蓝本，主要内容包括大肠杆菌的培养，DNA和RNA的提取和检测，利用聚合酶链式反应（PCR）获取目的基因，目的基因的克隆、转化与表达，基因的定点突变，cDNA文库和高通量测序（NGS）文库的构建，供生物技术、生物医药等专业的高职学生和企业一线的工作人员选用。本书采用项目式编写方法，从项目描述、项目分析、项目实施、结果呈现、思考题、时间安排、项目资料来组织教学内容。每个项目从任务描述引入并下达任务，通过项目分析弄清项目的基本原理、待解决的问题以及需要的各种设备、试剂和耗材，项目最后附有项目资料，主要包含本项目相关的理论知识，帮助学生解决在项目准备、实施和分析更多...

关键词：基因工程高等职业教育教材

来源：汇雅图书（南通市图书馆... 评论

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汇雅图书（南通市图书馆）

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科教导刊 2023年第3期 124-126页

作者：吴凡覃鸿妮谢钰珍张勇苏州工业园区服务外包职业学院江苏苏州215123

文章基于校企协同深入合作之大趋势,围绕职业教育与产业、行业对接的需求,以已有的国家级工程协同创新中心和区域生物医药公共实训基地为支撑,联合省级产教融合型试点企业共建生物医药产业学院,共同开展“基因工程技术”课程改革,通过... 详细信息

文章基于校企协同深入合作之大趋势,围绕职业教育与产业、行业对接的需求,以已有的国家级工程协同创新中心和区域生物医药公共实训基地为支撑,联合省级产教融合型试点企业共建生物医药产业学院,共同开展“基因工程技术”课程改革,通过介绍在课程设计、教学实施、学业评价等方面的具体做法,以期为地方院校相课程改革提供参考,切实提高区域人才培养质量。

关键词：课程改革校企协同课堂生态基因工程

基于校企双主体培养模式下高职院校《生物化学技术》课程改革与实践

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中文科技期刊数据库（全文版）教育科学 2022年第10期 223-226页

作者：胡海艳覃鸿妮关炜佳罗凯薛高旭苏州工业园区服务外包职业学院江苏苏州215123 SISO-金唯智生物科技学院江苏苏州215123

基于校企双主体育人,依托生物医药产业园内的产业集群设置专业群,与业内龙头和成长型企业共建生物医药产业学院和,从重构教学内容、调整教学过程、健全课程考核体系三方面入手,研究校、企双主体育人模式下的《生物化学》课程的教学改革... 详细信息

基于校企双主体育人,依托生物医药产业园内的产业集群设置专业群,与业内龙头和成长型企业共建生物医药产业学院和,从重构教学内容、调整教学过程、健全课程考核体系三方面入手,研究校、企双主体育人模式下的《生物化学》课程的教学改革与实践,实现“合作育人,融合发展”,提升高技能人才培养的质量。本文就此展开了相关内容的探究。

关键词：双主体生物化学实践教学课程改革