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水流动力学进行基因免疫制备单克隆抗体

水流动力学进行基因免疫制备单克隆抗体

作者：袁艳军河南大学

学位级别：硕士

背景自抗体技术产生以来,通常以蛋白质作为抗原免疫小鼠。这些用于免疫的蛋白质通常从组织细胞中分离提纯或通过基因工程表达,其制备过程操作繁杂,且实验周期长;有些蛋白质的构象表位易发生改变,有些蛋白质甚至无法获得。用合成肽来取... 详细信息

背景自抗体技术产生以来,通常以蛋白质作为抗原免疫小鼠。这些用于免疫的蛋白质通常从组织细胞中分离提纯或通过基因工程表达,其制备过程操作繁杂,且实验周期长;有些蛋白质的构象表位易发生改变,有些蛋白质甚至无法获得。用合成肽来取代蛋白质,价格昂贵、产量小。此外SARS以及禽流感、手足口等突发传染病不断地警示我们:突发传染性疾病随时可能给人类带来的灾难。这些突发传染病原常常亚型众多,加上基因突变、重组和重排,使其变异极快,早期血清学诊断无疑对预防、控制其传播具有重要意义。血清学诊断的前提是获得特异性抗体。制备抗体的传统方法速度慢并且费力。利用基因免疫方法(genetic immunization)制备单抗的原理是将编码目的蛋白的基因(代替常规的蛋白质抗原)经各种基因转移途径转入机体细胞,表达目的蛋白。目的蛋白在体内作为抗原,激发免疫应答,然后进行常规的细胞融合。基因免疫制备单抗可以制备针对天然表位的抗体,而且节省制备单抗时间2-3个月,是一种很有前途的抗体制备方法。目前常用的基因免疫方法,转基因的表达水平由于这种局部注射而相当低并且仅局限在注射部位。通过传统方法静脉注射质粒DNA,虽然可以使DNA分布在很多器官,但是质粒DNA进入体内后,迅速被血液及组织表面的核酸酶降解并且很快从血液循环中清除。为了克服这些问题,1999年Liu及Zhang等经小鼠尾静脉快速注射(3-8 s内完成)大体积质粒DNA溶液(占小鼠体重的8%-12%),发现在短时间内小鼠多种组织中即有目的基因的表达,其中在肝脏组织中表达水平最高,这种方法被称为水流动力学注射(hydrodynamics-based procudure)。应用此方法大大提高了质粒DNA的转染效率,从而升高了蛋白的表达。水流动力学出现以来,在基因治疗方面被得到广泛的应用,但是在基因免疫制备抗体方面却未有报道。死亡受体5(death receptor,DR5)是肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的主要受体之一,TRAIL可引起许多肿瘤细胞系的凋亡,对绝大多数正常细胞不具有凋亡效应,被认为是癌症治疗的潜在的生物制剂。DR5与TRAIL结合后可以通过其胞内的死亡结构域传递凋亡信号,从而引起细胞凋亡的发生,是激活凋亡途径的很好的靶标。目的通过水流动力学方法提高基因转移的效率,从而制备高效价的血清,并提高基因免疫制备单抗的效率,为制备抗体提供一条新的路径。方法将DR5基因克隆pcDNA3.0载体中,测序鉴定正确。分别通过水流动力学注射法和常规肌肉注射方法免疫小鼠,通过免疫组化和Western blot鉴定表达产物,ELISA测定抗体的效价。通过杂交瘤技术筛选抗DR5单克隆抗体。通过非竞争ELISA方法分析了单抗的亲和常数,通过ELISA方法分析了单抗的亚型,流式细胞术检测单抗与Jurkat细胞表面的DR5结合。结果构建了真核表达重组质粒pcDNA3.0/DR5。通过水流动力学方法和肌肉注射两种方法免疫小鼠,间接ELISA结果显示末次免疫后水流动力学免疫组抗体滴度最高可达到为1:102 400,肌肉注射免疫组抗体滴度最高为1:25 600:Western blot结果显示小鼠抗DR5多克隆抗体识别识别Jurkat细胞的DR5蛋白条带。免疫组化结果表明转染的DR5蛋白主要表达在食管癌细胞核膜周围,与预期相符。通过细胞融合技术成功制备了一株抗DR5单克隆抗体A9。经分析其亚型为IgM,非竞争ELISA结果显示A9的亲合常数为1.64×10～9L/mol。流式细胞仪检测显示A9可以与Jurkat细胞表面的DR5特异性结合。结论本课题以DR5为例,建立了利用水流动力学进行基因免疫,制备抗体的新方法。该方法与常规的蛋白免疫方法相比,具有节省制备单抗时间,可以制备针对天然表位的抗体的优点;与肌肉免疫进行基因免疫方法相比,可以产生更高效价的血清,在western-blot试验中获得更好的效果,更加容易制备单克隆抗体。

关键词：水流动力学基因免疫单克隆抗体

入而有度出而有法——2007年高考现代文阅读命题预测及备考策略

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语文教学通讯（高中）（A） 2007年第5期 50-51页

作者：李丹袁艳军赵英屏常远志关文丽黑龙江哈尔滨市第三中学 150090

科技文阅读部分一、考纲解读与考点把握（一）理解类,能力层级B。包括两方面内容。第一,“理解文中重要词语的含义”。“重要词语”是就这个词语在文中的作用而言的,“在文中”是理解的关键。考查题目常表述为“对……的理解正确（不正... 详细信息

科技文阅读部分一、考纲解读与考点把握（一）理解类,能力层级B。包括两方面内容。第一,“理解文中重要词语的含义”。“重要词语”是就这个词语在文中的作用而言的,“在文中”是理解的关键。考查题目常表述为“对……的理解正确（不正确）的一项是”。第二,“理解文中重要句子的含意”。“重要句子”是指这些句子对于理解文意具有重要的作用,常表现为结构复杂或内涵丰富。

关键词：现代文阅读备考策略命题预测高考阅读部分能力层级科技文词语

入而有度出而有法——2007年高考现代文阅读命题预测及备考策略

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语文教学通讯 2007年第15期 50-51页

作者：李丹袁艳军赵英屏常远志关文丽黑龙江哈尔滨市第三中学黑龙江哈尔滨市第三中学 150090

科技文阅读部分一、考纲解读与考点把握(一)理解类,能力层级B。包括两方面内容。第一,“理解文中重要词语的含义”。“重要词语”是就这个词语在文中的作用而言的,“在文中”是理解的关键。考查题目常表述为“对……的理解正确(不正确)... 详细信息

科技文阅读部分一、考纲解读与考点把握(一)理解类,能力层级B。包括两方面内容。第一,“理解文中重要词语的含义”。“重要词语”是就这个词语在文中的作用而言的,“在文中”是理解的关键。考查题目常表述为“对……的理解正确(不正确)的一项是”。第二,“理解文中重要句子的含意”。“重要句子”是指这些句子对于理解文意具有重要的作用,常表现为结构复杂或内涵丰富。考查题目常

关键词：文学作品现代文试题评析备考策略内容要点

JNK信号传导通路在抗人DR5单克隆抗体mDRA-6诱导白血病细胞凋亡中的作用

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中国免疫学杂志 2009年第10期25卷 916-919页

作者：蔡静李淑莲王靖王赟袁艳军蒋祺秦方园马远方河南省天然药物与免疫工程重点实验室河南大学免疫学研究所开封475004

目的:探讨JNK信号传导通路在抗人DR5单克隆抗体mDRA-6诱导白血病细胞Jurkat和U937凋亡过程中的作用。方法:MTT法检测mDRA-6对Jurkat和U937细胞的生长抑制作用;以Caspase抑制剂Z-VAD-FMK和JNK抑制剂SP600125进行干预,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量分析Jurkat和U937细胞凋亡;利用免疫印迹技术检测mDRA-6作用下凋亡细胞的JNK蛋白的表达情况。结果:mDRA-6对Jurkat和U937细胞具有明显的生长抑制作用;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测显示,10μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937细胞3小时,其凋亡率分别为62.62%和35.65%,JNK抑制剂干预后细胞凋亡明显增加;免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用细胞5分钟后JNK即呈现活性片段表达,并随作用时间的延长其活性增强,而Caspase全抑制剂干预后,5、15分钟JNK磷酸化增强,但随后随时间递减。结论:mDRA-6抑制Jurkat和U937细胞生长并诱导其凋亡,其凋亡过程中有JNK的激活并发挥抗凋亡作用。

关键词： JNK 抗死亡受体5单克隆抗体白血病细胞凋亡

示范引领，发展同行——王明伟校长发展共同体工作纪实

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教育家 2022年第27期 12-13页

作者：王明伟袁艳军

为推动区域教育均衡、高质量发展，2018年哈尔滨市教育局和市教育研究院联合启动了校长发展共同体项目。哈尔滨市第三中学校作为省级示范性高中，与哈尔滨市第四中学、第十三中学、第十四中学、第六十四中学、第七十三中学、第一六二中...

为推动区域教育均衡、高质量发展，2018年哈尔滨市教育局和市教育研究院联合启动了校长发展共同体项目。哈尔滨市第三中学校作为省级示范性高中，与哈尔滨市第四中学、第十三中学、第十四中学、第六十四中学、第七十三中学、第一六二中学、尚志中学、呼兰一中、阿城一中、依兰县达连河高级中学等十所学校结成“王明伟校长发展共同体”。共同体秉承“一体管理、优势互补、协同共进、特色发展”的工作原则，坚持问题导向，强化项目建设，塑造共同体文化品牌。三年来，

关键词：

不同年龄高龄经产妇性激素水平对再次孕育的影响

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国际检验医学杂志 2017年第8期38卷 1125-1126页

作者：袁艳军郭秋延孙艳艳河南省平顶山市妇幼保健院检验科 467000

目的探讨不同年龄高龄经产妇女的性激素水平对再次生育的影响。方法选择2013年11月至2016年3月来该院就诊的高龄经产妇725例,按照年龄和是否正常怀孕分为A研究组、A对照组,B研究组、B对照组。对所有分组进行6项性激素测定,探讨各项性激... 详细信息

目的探讨不同年龄高龄经产妇女的性激素水平对再次生育的影响。方法选择2013年11月至2016年3月来该院就诊的高龄经产妇725例,按照年龄和是否正常怀孕分为A研究组、A对照组,B研究组、B对照组。对所有分组进行6项性激素测定,探讨各项性激素水平和年龄对高龄经产妇再次孕育的影响。结果两个研究组中雌二醇(E2)水平均明显低于其对照组,且差异具有统计学意义(P35~40岁A研究组催乳素(PRL)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睾酮(T)水平均明显高于A对照组,且差异具有统计学意义(P40岁B研究组LH、FSH、PRL水平均明显高于B对照组,且差异具有统计学意义(P35~40岁组E2水平明显低于>40岁组,T水平明显高于>40岁组,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论性激素水平对高龄经产妇女再次孕育有重要意义。

关键词：高龄经产妇性激素再孕育

化学发光微粒子免疫分析法检测梅毒和丙型肝炎抗体的临床结果分析

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中国医药指南 2015年第3期13卷 128-129页

作者：袁艳军吕炳山郭秋延河南省平顶山市妇幼保健院检验科河南平顶山467000

目的应用化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)检测梅毒抗体和丙型肝炎抗体,并与常规筛查梅毒和丙型肝炎的方法进行对比分析。方法对我院2013年1月至2014年4月17033例患者血清分别使用CMIA、酶联免疫吸附试验(ELISA)和金标法进行丙型肝炎抗... 详细信息

目的应用化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)检测梅毒抗体和丙型肝炎抗体,并与常规筛查梅毒和丙型肝炎的方法进行对比分析。方法对我院2013年1月至2014年4月17033例患者血清分别使用CMIA、酶联免疫吸附试验(ELISA)和金标法进行丙型肝炎抗体检测,对梅毒抗体分别使用CMIA、梅毒螺旋体抗体凝集法(TPPA)和金标法进行检测。结果在全部17033例检测样本中,使用CMIA检测出HCV抗体阳性标本共89份,检出阳性率为0.52%;TP-CMIA阳性标本213份,检出阳性率为1.25%。与对比方法检出阳性差异无统计学意义。CMIA检测值越高,三种方法的阳性检出结果差异越小。结论 CMIA明显优于ELISA和金标法,具有更好的敏感性和特异性,重复性强,操作简便,大大降低了低水平感染者漏检和假阳性、假阴性结果的可能性,降低了医疗纠纷发生率。

关键词：化学发光微粒子免疫分析梅毒抗体丙型肝炎抗体

SAA联合外周血细胞形态学对小儿病毒性呼吸道感染病情诊断的价值

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海南医学 2024年第5期35卷 704-708页

作者：袁艳军田二军张嫚平顶山市妇幼保健院检验科河南平顶山467000 平顶山市第一人民医院检验科河南平顶山467000 平顶山市第一人民医院儿科河南平顶山467000

目的探讨血清淀粉样蛋白A (SAA)联合外周血细胞形态学对小儿病毒性呼吸道感染病情诊断的特异性及敏感性。方法按照1∶1比例选取2022年8月至2023年8月平顶山市妇幼保健院收治的122例血常规正常小儿病毒性呼吸道感染患儿(病毒组)及122... 详细信息

目的探讨血清淀粉样蛋白A (SAA)联合外周血细胞形态学对小儿病毒性呼吸道感染病情诊断的特异性及敏感性。方法按照1∶1比例选取2022年8月至2023年8月平顶山市妇幼保健院收治的122例血常规正常小儿病毒性呼吸道感染患儿(病毒组)及122例健康儿童(对照组)进行前瞻性研究,检测并比较两组儿童外周血细胞形态学(核左移、反应性淋巴细胞比例)改变及SAA水平。统计外周血细胞形态学(核左移、反应性淋巴细胞比例)改变及SAA检出血常规正常小儿病毒性呼吸道感染情况,以病原学诊断结果为金标准,分析外周血细胞形态学改变、SAA及联合检测对小儿病毒性呼吸道感染病情诊断的特异性及敏感性。比较不同病情程度患儿外周血细胞形态学改变及SAA水平,应用Spearman分析外周血细胞形态学改变及SAA水平与病情程度相关性。结果病毒组儿童的核左移数量、反应性淋巴细胞比例及血清SAA分别为(9.54±3.15)个、(5.94±1.87)%、(29.60±9.53) mg/L,明显高于对照组的(2.27±0.66)个、(0.32±0.20)%、(3.60±0.92) mg/L,差异均有统计学意义(P<0.05);以病原学诊断结果为金标准,外周血细胞形态学改变联合SAA诊断小儿病毒性呼吸道感染的敏感度(98.36%)、特异度(99.18%)、准确率(98.77%)最高,漏诊率(1.64%)最低(P<0.05);重症肺炎儿童的核左移数量、反应性淋巴细胞比例、血清SAA分别为(15.87±5.02)个、(14.26±3.78)%、(47.25±11.33) mg/L,明显高于普通肺炎儿童的(10.61±2.30)个、(5.13±1.54)%、(30.29±8.57) mg/L和上呼吸道感染儿童的(6.09±1.54)个、(6.09±1.54)%、(22.32±4.40) mg/L,而普通肺炎儿童的核左移数量、反应性淋巴细胞比例、血清SAA明显高于上呼吸道感染儿童,差异均有统计学意义(P<0.05);经Spearman分析结果显示,核左移数量、反应性淋巴细胞比例、SAA水平与病情程度均呈正相关(r=0.725、0.801、0.820,P<0.05)。结论小儿病毒性呼吸道感染反应性淋巴细胞比例及血清SAA增高,核左移明显,在血常规检测不能反映临床表现的情况下,联合外周血细胞形态学改变、SAA可为临床诊断提供可靠的感染证据及病原学信息,从而指导临床做出正确的治疗决策方案。

关键词：儿童病毒性呼吸道感染血常规正常外周血细胞形态学血清淀粉样蛋白A 病情程度

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妊娠期甲状腺功能指标筛查的临床分析

实用检验医师杂志 2015年第1期7卷 57-59页

作者：袁艳军郭秋延李兵锐吕炳山河南省平顶山市妇幼保健院检验科平顶山市467000

目的分析正常妊娠早中晚期孕妇甲状腺功能指标筛查的结果 ,了解本地区孕妇甲状腺功能异常患病率。方法选取来我院孕检的孕妇3638例,分为早期妊娠妇女498例、中期妊娠妇女2412例和晚期妊娠妇女728例,不同孕期再按年龄分为≤30岁组和>30岁... 详细信息

目的分析正常妊娠早中晚期孕妇甲状腺功能指标筛查的结果 ,了解本地区孕妇甲状腺功能异常患病率。方法选取来我院孕检的孕妇3638例,分为早期妊娠妇女498例、中期妊娠妇女2412例和晚期妊娠妇女728例,不同孕期再按年龄分为≤30岁组和>30岁组,采用电化学发光法对各组妇女的血清促甲状腺素(thyrotropin,TSH)、游离三碘甲状腺氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine,FT4)和甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)4项甲状腺功能指标进行检测,并对检测结果进行统计学分析。结果 FT3、FT4随着孕期的延长逐渐降低,TSH和TPOAb随着孕期延长逐渐升高,且各项指标妊娠各期≤30岁组和>30岁组差异均有统计学意义(P均30岁组患者甲减、亚临床甲减、低FT4血症、甲亢、亚临床甲亢的阳性率均高于≤30岁组患者,而单纯TPOAb阳性低于≤30岁组,且差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论不同孕期不同年龄段的甲状腺功能指标存在差异,应加强本地区不同孕期孕妇甲状腺功能指标正常参考范围的研究。低风险孕妇仍有较高的甲状腺功能异常率,建议全面开展孕期甲状腺功能检测,及时发现和治疗甲状腺疾病。

关键词：妊娠甲状腺功能游离三碘甲状腺氨酸游离甲状腺素促甲状腺素