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银杏MECT、MECPs基因启动子克隆及植物表达载体构建

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银杏MECT、MECPs基因启动子克隆及植物表达载体构建

作者：袁红慧武汉工程大学

学位级别：硕士

银杏萜内酯是从银杏叶中提取的一种重要的药物活性成分，具有保护中枢神经系统、降低缺血损伤、抗休克、抗过敏等多方面的药理作用，因而成为近几年的研究热点。为了解萜内酯合成的代谢网络，深入研究其合成过程的分子机理，并为利用生... 详细信息

银杏萜内酯是从银杏叶中提取的一种重要的药物活性成分，具有保护中枢神经系统、降低缺血损伤、抗休克、抗过敏等多方面的药理作用，因而成为近几年的研究热点。为了解萜内酯合成的代谢网络，深入研究其合成过程的分子机理，并为利用生物技术提高萜内酯含量提供可靠依据。本实验以银杏家佛手为研究材料，采用染色体步移的方法从银杏中克隆了萜内酯合成MEP途径中的两个关键酶基因2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因(GbMECT)和2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶基因(GbMECPs)的启动子序列，并对其调控元件进行了初步分析，在获得启动子序列后对其中的GbMECPs启动子进行了植物表达载体构建。主要研究内容和结果如下： (1)银杏2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因(GbMECT)启动子克隆及序列分析。通过设计特异性引物及采用染色体步移方法从银杏基因组中克隆到GbMECT翻译起始位点上游982bp的启动子序列。生物信息学分析表明，该启动子序列中含有多种类型的顺式作用元件，主要有典型的光响应调节元件GATA-box(GATA)、GT-1motif (GRWAAW)及I-box (GATAA)等;抗逆境胁迫及与激素响应相关的调控元件包括：细胞分裂素响应元件ARR1(NGATT)和CPBCSPOR (TATTAG)，脱落酸响应元件MYC (CANNTG)和MYB1AT (WAACCA)，赤霉素响应元件WRKY-motif (TGAC)、GARE (TAACAGA)及GA-element (TAACAAR)等，生长素响应元件ASF-1motif (TGACG)和乙烯响应元件ACS (TAAAATAT)，另有抗病虫害响应元件TGTCA序列，抗损伤应答元件ERF3(TGACY)和高温胁迫应答元件HSE-motif(CCAAT)等。在该启动子片段中还含有氧胁迫和铜离子响应元件、淀粉酶响应元件等其他类型的作用元件，充分体现了启动子对基因表达调控具有转录水平上的高效性和复杂性的特点。 (2)银杏2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶基因(GbMECPs)启动子克隆及植物表达载体构建。通过染色体步移方法从银杏基因组中克隆到长约为744bp的GbMECPs启动子片段，生物信息学分析表明，该启动子序列含有多个基本顺式作用元件TATA-box和CAAT-box，及典型的光调节元件GT-1motif (GRWAAW)、Circadianbox (CAANNNNATC)等。进一步分析发现，该调控序列还包含对生长素、赤霉素、乙烯利、细胞分裂素、脱落酸等各种激素应答相关的调控元件及MYB、MYC转录因子介导的多种逆境胁迫诱导元件。将克隆的GbMECPs启动子替换质粒pBI121中的35S启动子，成功构建了由GbMECPs启动子驱动gus报告基因的植物表达载体pBI121+GbMECPs。下一步拟用农杆菌介导法将重组质粒转入烟草，为深入研究该启动子组织特异性表达及胁迫诱导机理分析奠定基础。

关键词：银杏染色体步移 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因 2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶基因调控元件植物表达载体

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银杏叶片中萜内酯的提取工艺

北方园艺 2017年第23期 176-180页

作者：李泽宏冯如袁红慧程华程水源武汉轻工大学生物与制药工程学院湖北武汉430023

以银杏叶片为试材,采用乙醇-水浸提法,设计单因素试验,研究了乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度4个提取参数对萜内酯得率的影响,优化了提取工艺。结果表明:提取萜内酯的最佳工艺为料液比1∶150g·mL^(-1),提取温度60℃,60%乙醇,提取... 详细信息

以银杏叶片为试材,采用乙醇-水浸提法,设计单因素试验,研究了乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度4个提取参数对萜内酯得率的影响,优化了提取工艺。结果表明:提取萜内酯的最佳工艺为料液比1∶150g·mL^(-1),提取温度60℃,60%乙醇,提取2.0h;最佳洗脱条件是石油醚∶乙酸乙酯=1∶2(v/v),一次性洗脱。经过HPLC-ELSD分析,该工艺提取率高,操作简便,具有可信度。

关键词：银杏叶片萜内酯提取工艺

银杏胞质抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)克隆及表达特性分析(英文)

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果树学报 2013年第2期30卷 214-221页

作者：程华李琳玲许锋袁红慧吴聪华程水源王燕经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室湖北黄冈438000 黄冈师范学院化学与生命科学学院湖北黄冈438000

【目的】分离和克隆银杏细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因GbAPX1(GenBank登录号为FJ555021),了解其在银杏正常组织发育以及响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】利用同源克隆及RACE技术从银杏叶片细胞质中分离得到GbAPX1全... 详细信息

【目的】分离和克隆银杏细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因GbAPX1(GenBank登录号为FJ555021),了解其在银杏正常组织发育以及响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】利用同源克隆及RACE技术从银杏叶片细胞质中分离得到GbAPX1全长cDNA序列,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推测的氨基酸序列进行分析,并用实时定量PCR方法研究GbAPX1在不同组织、不同激素和胁迫处理下的表达模式。【结果】克隆GbAPX1基因全长cDNA序列为965 bp,包含一个759 bp的最大读码框,编码252个氨基酸;预测该基因编码蛋白质分子量为27.6 kDa,其等电点为5.81。系统进化树分析表明,GbAPX1和其他裸子植物同源性较高并聚为一类。qRT-PCR分析结果显示,GbAPX1表达具有组织和发育时期差异性,在成熟叶片和雄蕊中具有最高表达水平,在茎和嫩叶中表达水平较低。诱导表达分析表明,GbAPX1受到激素和环境压力诱导。其中,脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯和紫外辐射均能诱导其转录上升,而乙烯利和伤害处理对GbAPX1转录水平无显著影响。【结论】确认获得序列为GbAPX1基因cDNA序列;GbAPX1不仅参与了银杏正常的组织生长发育,还与一些环境胁迫和逆境相关激素诱导表达有关。

关键词：银杏胞质APX1 胁迫和激素调控

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内源激素含量变化与板栗花芽分化关系研究

北方园艺 2013年第22期 5-9页

作者：程华李琳玲袁红慧徐向阳王燕程水源经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室湖北黄冈438000 黄冈师范学院化学与生命科学学院湖北黄冈438000 湖北省林业厅科技教育处湖北武汉430079

以罗田板栗主栽品种"八月红"、"乌壳栗"、"中果早栗"、"玫瑰红"为试材,采用高效液相色谱方法,研究了板栗花芽分化不同时期体内吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)、脱落酸(ABA)等激素含量的变化。结果表明:在板栗冬前梢花芽分... 详细信息

以罗田板栗主栽品种"八月红"、"乌壳栗"、"中果早栗"、"玫瑰红"为试材,采用高效液相色谱方法,研究了板栗花芽分化不同时期体内吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)、脱落酸(ABA)等激素含量的变化。结果表明:在板栗冬前梢花芽分化过程中,IAA含量一直呈上升态势,并保持在一个较高水平;而ABA含量则呈先上升后下降、又略有上升趋势;GA3含量呈先上升后下降、之后保持在一个相对较低含量水平状态;ZR含量呈先上升后缓慢下降趋势。综合分析表明,IAA对板栗冬前梢花芽分化影响较大;低含量的ABA有利于板栗花簇原基的分化和生长,对花芽分化进程的影响有待进一步研究;GA3有利于花芽打破休眠其向花序原基分化的转化,且花序原基分化期与花簇原基分化期均需维持一定含量的GA3;高含量的ZR可能对板栗花芽分化具有促进作用。在对ZR/IAA、GA3/IAA、ABA/IAA、GA3/ZR值分析过程中发现,ZR/IAA、GA3/IAA、ABA/IAA值均呈现出先上升后下降的变化趋势,而GA3/ZR值则一直下降,之后保持在一个较低的水平。从整个板栗花芽分化过程中内源激素比例分析看,较高水平ZR/IAA、GA3/IAA及ABA/IAA值有利于板栗冬前梢打破休眠期进入花芽分化时期,但由花序原基进入花簇原基分化却需要较低水平的ZR/IAA、GA3/IAA及ABA/IAA值。通过内源激素比例变化趋势分析说明,板栗冬前梢花芽分化的启动和各阶段的进程与各内源激素的平衡有密切联系。

关键词：板栗内源激素比值变化

银杏MECPs基因启动子克隆及其植物表达载体的构建

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贵州农业科学 2013年第5期41卷 10-15页

作者：袁红慧程华李琳玲许锋程水源武汉工程大学化工与制药学院湖北武汉430073 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室湖北黄冈438000 黄冈师范学院化学与生命科学学院湖北黄冈438000

为深入研究银杏MECPs基因启动子的结构及功能特点,以前期获得的银杏MECPs基因的cDNA序列为模板,采用染色体步移技术(Genome Walking),从银杏基因组中扩增到一段GbMECPs基因启动子序列。结果表明:该启动子片段长度约为744bp,含有多个基... 详细信息

为深入研究银杏MECPs基因启动子的结构及功能特点,以前期获得的银杏MECPs基因的cDNA序列为模板,采用染色体步移技术(Genome Walking),从银杏基因组中扩增到一段GbMECPs基因启动子序列。结果表明:该启动子片段长度约为744bp,含有多个基本顺式作用元件TATA和CAAT-box及典型的光调节元件GT-1motif(GRWAAW)和Circadian box(CAANNNNATC)等。进一步分析发现,该调控序列还包含多个对生长素、赤霉素、乙烯利、细胞分裂素、脱落酸等各种激素应答相关的调控元件和MYB、MYC转录因子介导的多种逆境胁迫诱导元件。将克隆的GbMECPs启动子替换质粒pBI121中的35S启动子,成功构建了由GbMECPs启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体pBI121+GbMECPs。

关键词：银杏染色体步移 2-C-甲基赤藓醇-2 4-环焦磷酸合成酶基因调控元件植物表达载体

银杏两个WD40转录因子基因克隆及序列分析

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北方园艺 2017年第18期 100-108页

作者：冯如李泽宏袁红慧程华程水源武汉轻工大学生物与制药工程学院湖北武汉430023

WD40转录因子也称WDR(WD repeat)蛋白,是一种古老蛋白家族,参与调节类黄酮次生代谢途径中多种酶基因的表达,从而影响类黄酮的积累。以三年生银杏苗为试材,采用RT-PCR和RACE-PCR方法,研究了银杏WD40基因序列,以期深入了解银杏叶类黄酮合... 详细信息

WD40转录因子也称WDR(WD repeat)蛋白,是一种古老蛋白家族,参与调节类黄酮次生代谢途径中多种酶基因的表达,从而影响类黄酮的积累。以三年生银杏苗为试材,采用RT-PCR和RACE-PCR方法,研究了银杏WD40基因序列,以期深入了解银杏叶类黄酮合成代谢的分子机理。结果表明:GbWD401序列包含一段2 313bp的开放阅读框,编码一个770aa的肽链;GbWD402序列包含一段1 605bp的开放阅读框,编码一个534aa的肽链。银杏GbWD401和GbWD402基因推测编码蛋白序列均含有典型WD40重复基序。GbWD401蛋白序列与无油樟AtWD401相似性为49%,GbWD402蛋白序列与无油樟AtWD402相似性为78%。系统进化树发现,GbWD401与无油樟AtWD401、荷花NnWD40划归为同一分支;而GbWD402与无油樟AtWD402划归为另一分支。

关键词：银杏类黄酮 WD40转录因子基因克隆

银杏AP2/ERF转录因子鉴定及其ERF家族在逆境胁迫下的表达分析

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分子植物育种 2022年第1期20卷 113-123页

作者：袁红慧李琳玲程华肖贤程水源南京林业大学林学院南京210037 黄冈师范学院生物与农业资源学院经济林木种植改良与资源综合利用湖北省重点实验室黄冈438000 武汉轻工大学生物与制药工程学院武汉430023

AP2/ERF转录因子广泛参与银杏的生物学过程,其ERF基因家族存在着通过调控次生代谢来应对环境压力的可能。为探究ERF基因家族在这一过程中的应答机制,本研究分别构建了紫外和干旱处理下银杏叶转录组数据库,利用在线生物信息学工具对银杏A... 详细信息

AP2/ERF转录因子广泛参与银杏的生物学过程,其ERF基因家族存在着通过调控次生代谢来应对环境压力的可能。为探究ERF基因家族在这一过程中的应答机制,本研究分别构建了紫外和干旱处理下银杏叶转录组数据库,利用在线生物信息学工具对银杏AP2/ERF转录因子的保守结构域、理化性质及基因家族同源性进行分析,同时利用转录组测序技术检测了ERF基因家族在这两种逆境胁迫下的表达情况,筛选其中5个与类黄酮等代谢相关的ERF基因进行荧光定量PCR验证分析。结果表明,在银杏中共鉴定到61个AP2/ERF转录因子,根据其保守结构域特点分为4类,即ERF亚家族28个、DREB亚家族23个、AP2和RAV亚家族分别为5个。不同成员之间的氨基酸数目、等电点(pI)等理化性质有较大差别。从与拟南芥、大豆的序列同源性分析结果来看,同一个亚家族的成员之间亲缘关系较近。GbERF亚家族和GbDREB亚家族同属于银杏ERF基因家族,成员数最多。转录组预测分析结果显示,大部分ERF基因家族成员在紫外和干旱胁迫诱导下的基因表达量会增加。经验证,5个基因表达量的变化情况总体与预测结果一致。本实验结果为后期开展银杏ERF基因家族的功能研究提供科学依据。

关键词：银杏(Ginkgo biloba L.) AP2/ERF转录因子 ERF基因家族逆境胁迫

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板栗IFRs启动子分离及表达载体构建

北方园艺 2017年第11期 107-114页

作者：李琳玲陈小玲袁红慧程水源程华经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室湖北黄冈438000 大别山特色资源开发湖北省协同创新中心湖北黄冈438000 武汉轻工大学生物与制药工程学院湖北武汉430023

以湖北省罗田板栗品种乌壳栗为试材,采用染色体步移的方法获得了板栗IFR启动子序列,研究了板栗黄酮代谢途径中关键基因IFR的启动子顺式作用原件及可能对雄花黄酮类物质合成的影响,并构建pCAMBIA1304融合载体。以期揭示板栗雄花黄酮代谢... 详细信息

以湖北省罗田板栗品种乌壳栗为试材,采用染色体步移的方法获得了板栗IFR启动子序列,研究了板栗黄酮代谢途径中关键基因IFR的启动子顺式作用原件及可能对雄花黄酮类物质合成的影响,并构建pCAMBIA1304融合载体。以期揭示板栗雄花黄酮代谢合成途径,IFRs启动子上游所包含的顺式元件对环境和栽培措施的响应及对板栗雄花发育的影响。结果表明:长度为1 688bp的板栗IFRs启动子序列包含多种类型的顺式作用元件,包括光响应元件GT-1motif、ASF-1motif等;与赤霉素,脱落酸、乙烯等相关的激素响应元件,如WRKY motif(赤霉素信号途径转录因子)、GCC-box(乙烯应答元件)以及Dc3(脱落酸响应元件)等;逆境胁迫相关的功能元件,如与抗损伤相关的ERF3、抗病相关的TGTCA-box等。以此推测,CmIFR基因的表达可能会受到以上光、激素、各种生物或者非生物胁迫等因素的影响。为了后期进一步研究启动子的功能,按照启动子功能区域,设计了CmIFR启动子不同长度的6个功能片段,并将这些片段替换pCAMBIA1304中的35S启动子,成功构建了由CmIFRPs启动子不同区域驱动的gus基因的植物表达载体pCAMBIA1304+CmIFRPs。

关键词：板栗黄酮 IFR 调控元件表达载体构建

银杏GbERF1转录因子基因的克隆及亚细胞定位分析

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北方园艺 2018年第3期 92-100页

作者：李泽宏袁红慧程华李琳玲冯如程水源武汉轻工大学生物与制药工程学院湖北武汉430023 黄冈师范学院生命科学学院湖北黄冈438400

ERF是植物中一类重要的转录因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的响应。以3年生银杏苗为试材,采用RT-PCR与RACE-PCR方法,研究了银杏ERF基因序列,以期深入了解银杏药用成分合成代谢的分子机理。结果表明:GbERF1含有长度为1 314bp的完... 详细信息

ERF是植物中一类重要的转录因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的响应。以3年生银杏苗为试材,采用RT-PCR与RACE-PCR方法,研究了银杏ERF基因序列,以期深入了解银杏药用成分合成代谢的分子机理。结果表明:GbERF1含有长度为1 314bp的完整开放阅读框,编码437个氨基酸。蛋白序列分析显示,GbERF1蛋白含有2段ERF家族的特殊位点。GbERF1蛋白序列与北美云杉(ADE75663.1)序列的相似性为97%。系统进化树分析,GbERF1与北美云杉、狭叶羽扇豆的序列可划归为同一分支。实时荧光定量PCR结果显示,GbERF1主要在银杏根和叶中表达,逆境胁迫处理后显示,该基因在乙烯、紫外诱导处理下,表达量大幅度提升,随后下降,但仍高于对照组,干旱诱导处理下表达量先升高后降低,矮壮素(CCC)诱导下表达量变化不太明显。烟草叶片下表皮细胞亚细胞定位结果表明GbERF1定位于细胞核。

关键词：银杏 ERF转录因子荧光定量分析亚细胞定位