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内皮祖细胞介导TRAIL基因对小鼠肝细胞癌的治疗作用

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世界华人消化杂志 2012年第31期20卷 2986-2991页

作者：袁献温葛夏青孙喜太丁义涛南京大学医学院附属鼓楼医院江苏省南京市210008

目的:探索TRAIL基因转染内皮祖细胞对肝癌的治疗作用.方法:通过PCR扩增TRAIL基因,将TRAIL基因与pcDNA3.1载体连接,采用腺病毒转染入内皮祖细胞中,并用Western blot进行TRAIL基因的表达鉴定.建立小鼠皮下移植瘤动物模型,用携带TRAIL基因... 详细信息

目的:探索TRAIL基因转染内皮祖细胞对肝癌的治疗作用.方法:通过PCR扩增TRAIL基因,将TRAIL基因与pcDNA3.1载体连接,采用腺病毒转染入内皮祖细胞中,并用Western blot进行TRAIL基因的表达鉴定.建立小鼠皮下移植瘤动物模型,用携带TRAIL基因的重组腺病毒转染内皮祖细胞,经尾静脉注射,同时以生理盐水和空载腺病毒为对照,分别观察治疗效果.结果:经酶切及测序鉴定,TRAIL基因与pcDNA3.1的重组质粒构建成功.Western blot检测发现TRAIL基因转染入内皮祖细胞后有表达.转染TRAIL基因组的抑瘤率为47.77%,肿瘤体积平均值为0.791cm3±0.119cm3,肿瘤质量平均值为0.29g±0.04g,经统计学分析与对照组有显著性差异.结论:TRAIL基因成功转染入内皮祖细胞并表达,TRAIL基因转染内皮祖细胞可以明显抑制H22移植瘤的生长,且无明显不良反应.

关键词： TRAIL基因肝细胞癌基因治疗

一株具有抗肿瘤活性的海洋放线菌的分离和鉴定

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微生物学通报 2009年第1期36卷 78-83页

作者：袁献温杨瑞丽东南大学医学院病原生物学和免疫学系江苏南京210009

海洋放线菌ACMA006的发酵产物具有很强的抗肿瘤活性和较好的抑菌效果,但对人常细胞毒性较弱。该菌株在大多数培养基上生长良好,产生可溶性色素;基质菌丝在培养早期现横隔,随后发生断裂;最适生长温度为28°C。基于16SrDNA序列的系统发育... 详细信息

海洋放线菌ACMA006的发酵产物具有很强的抗肿瘤活性和较好的抑菌效果,但对人常细胞毒性较弱。该菌株在大多数培养基上生长良好,产生可溶性色素;基质菌丝在培养早期现横隔,随后发生断裂;最适生长温度为28°C。基于16SrDNA序列的系统发育分析表明,菌ACMA006属于链霉菌属(Streptomyces)的成员,与该属的合格发表种卡伍尔链霉菌华盛顿亚(S.cavourensis subsp.washingtonensis)的16SrDNA序列相似性最高,同源性达100%,但在部分态特征和理化特性上存在较大差异。初步确定ACMA006属于卡伍尔链霉菌华盛顿亚种的一个洋变种。

关键词：抗肿瘤活性海洋放线菌 16S rDNA 系统发育分析

抗肿瘤海洋放线菌ACMA006发酵条件的优化

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中国海洋药物 2008年第6期27卷 5-9页

作者：袁献温杨瑞丽曹雪东南大学医学院病原生物学和免疫学系江苏南京210009

目的为提高海洋放线菌ACMA006抗肿瘤活性物质的产量而对其发酵条件进行优化。方法包括对发酵培养基的组成、种龄、温度、通气量和发酵时间等条件的研究,选择最优的发酵条件。结果最佳培养基为:大豆粉10g,胰蛋白胨5g,酵母膏10g,可溶性淀... 详细信息

目的为提高海洋放线菌ACMA006抗肿瘤活性物质的产量而对其发酵条件进行优化。方法包括对发酵培养基的组成、种龄、温度、通气量和发酵时间等条件的研究,选择最优的发酵条件。结果最佳培养基为:大豆粉10g,胰蛋白胨5g,酵母膏10g,可溶性淀粉15g,甘油15g,KH2PO40.5g,陈海水1000mL,pH7.2。最佳培养条件:温度28℃,种龄6d,装液量33%(V/V),发酵时间8d。结论在此优化条件下,菌株ACMA006的生物量为78.1g.L-1,发酵液稀释4000倍时,对人肝癌细胞HepG2的抑制率为93.7%。

关键词：海洋放线菌抗肿瘤活性物质发酵优化

鱼油脂肪乳对肠外营养大鼠小肠黏膜紧密连接形态结构的影响

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肠外与肠内营养 2012年第4期19卷 223-227页

作者：王萌汪灏袁献温管文贤南京大学医学院附属鼓楼医院普通外科江苏南京210008

目的:探讨鱼油脂肪乳剂(富含ω-3多不饱和脂肪酸)对肠外营养(PN)大鼠肠上皮细胞紧密连接(TJ)形态和紧密连接蛋白occludin表达的影响。方法:将大鼠随机分为四组,即对照组(正常喂食),PN(禁食5d行PN支持)组,小剂量鱼油治疗(1 ml/kg鱼油静... 详细信息

目的:探讨鱼油脂肪乳剂(富含ω-3多不饱和脂肪酸)对肠外营养(PN)大鼠肠上皮细胞紧密连接(TJ)形态和紧密连接蛋白occludin表达的影响。方法:将大鼠随机分为四组,即对照组(正常喂食),PN(禁食5d行PN支持)组,小剂量鱼油治疗(1 ml/kg鱼油静脉注射+PN)组和大剂量鱼油治疗(2 ml/kg鱼油静脉注射+PN)组。观察大鼠术后小肠黏膜上皮细胞TJ形态,以及紧密连接蛋白occludin的表达分布。结果:PN组大鼠治疗5 d后肠上皮细胞TJ结构部分缺失、间隙增宽;大剂量鱼油治疗组TJ形态基本完整,小剂量鱼油治疗组TJ部分缺失。各组occludin蛋白总量无明显差异。提取脂筏组分,发现与对照组比,三个实验组脂筏区域中occludin蛋白表达均明显减少,但大剂量鱼油治疗组较PN组明显升高(P<0.01)。结论:长期PN可导致TJ结构的缺失,脂筏区域紧密连接蛋白occludin表达减少。大剂量鱼油脂肪乳剂可维持occludin蛋白在脂筏区域的表达,保护小肠黏膜细胞TJ的结构和功能。

关键词： ω-3多不饱和脂肪酸紧密连接肠外营养脂筏

骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭的治疗作用及机制

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中华肝胆外科杂志 2017年第10期23卷 694-699页

作者：马虎成王鑫吴旻娜袁献温施晓雷南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科 210008 南京中医药大学第一临床医学院

目的探索骨髓间充质干细胞（MSCs）分泌的炎症相关因子及其对急性肝衰竭（ALF）的治疗作用。方法获取并鉴定sD大鼠MSCs。收集MSCs条件培养基（MSCs—CM）检测炎症相关因子。SD大鼠分为三组：ALF＋达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM）组... 详细信息

目的探索骨髓间充质干细胞（MSCs）分泌的炎症相关因子及其对急性肝衰竭（ALF）的治疗作用。方法获取并鉴定sD大鼠MSCs。收集MSCs条件培养基（MSCs—CM）检测炎症相关因子。SD大鼠分为三组：ALF＋达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM）组：D－氨基半乳糖（D—Gal）诱导大鼠ALF后静脉输注DMEM 1ml；ALF＋MSCs组：诱导ALF后静脉输注MSCs 1ml（约1×10^6）；ALF＋MSCs—CM组：诱导ALF后静脉输注MSCs—CM 1ml。检测各组大鼠生化指标、4周存活率、组织病理学和炎症因子水平。评估直接输注外源性重组大鼠白介素10（IL-10）与给予抗白介素10抗体后输注MSCs-CM对ALF大鼠转氨酶的影响。检测给予IL—10后ALF大鼠肝脏磷酸化STAT3（pSTAT3）水平，评估AG490（STAT3信号通路抑制剂）能否逆转IL-10的治疗作用。结果ALF＋DMEM组、ALF＋MSCs组和ALF＋MSCs—CM组给予D—Gal第3天血清ALT分别为1709．8±372．1、865．5±52．8、964．7±414．6U／L，AST分别为4234．0±807．3、2440．8±511．9、2739．8±587．3U／L，TBil分别为79．3±10．9、43．8±7．0、61．2±6．7μg／L。三组28天存活率分别为10．0％、80．0％、70．0％；炎症因子干扰素（IFN-γ）分别为69．8±4．7、46．4±4．3、54．6±2．4pg／ml，IL-113分别为58．5±7．6、40．5±6．9、44．1±6．0pg／ml，IL-6分别为71．9±16．1、38．4±7．7、45．3±9．0pg／ml，IL-10分别为38．3±6．0、75．4±11．1、59．6±11．9pg／ml。蛋白芯片检测提示MSCs-CM表达多种炎症相关细胞因子，其中IL-10的水平最为显著。与ALF组（ALT：1709．8±372．1U／L，AST：4234．0±807．3U／L）比较，单独使用IL-10（ALT：1126．9±419．3U／L，AST：2370．8±561．2U／L）能显著降低转氨酶水平，同时给予抗IL-10抗体（ALT：1568．5±325．4U／L，AST：4043．7±819．0U／L）则能中和ISCs-CM（ALT：964．7±414．6U／L，AST：2739．8±587．3U／L）的治疗作用。给予IL-10能够显著提高ALF大鼠肝脏pSTAT3水平（0．93±0．03比0．68±0．01），而STAT3抑制剂AG490（0．84±0．04）则能降低pSTAT3的表达，逆转IL-10的治疗作用。结论MSCs分泌的IL-10能够减轻D—Gal诱导的大鼠急性肝损伤，STAT3信号通路或许介导该治疗作用。

关键词：骨髓间充质干细胞急性肝衰竭条件培养基免疫调节 STAT3信号通路

CXCR4转染的骨髓间充质干细胞靶向治疗急性肝衰竭

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世界华人消化杂志 2014年第16期22卷 2229-2236页

作者：马虎成施晓雷任昊桢袁献温丁义涛南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科江苏省南京市210008

目的:提高骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)移植治疗急性肝衰竭时在肝脏的定植率及疗效.方法:采用慢病毒转染使MSC过表达CXCR4基因,RT-PCR和细胞流式检测CXCR4表达.ELISA实验检测肝衰竭裸鼠肝脏MSC向基质衍生因子-1α(strom... 详细信息

目的:提高骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)移植治疗急性肝衰竭时在肝脏的定植率及疗效.方法:采用慢病毒转染使MSC过表达CXCR4基因,RT-PCR和细胞流式检测CXCR4表达.ELISA实验检测肝衰竭裸鼠肝脏MSC向基质衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)水平.迁移实验检测转染的SDF-1α趋化能力.20%(V/V)四氯化碳(CCl4)橄榄油溶液8μL/g腹腔注射诱导裸鼠急性肝衰竭模型,24 h后尾静脉注射CXCR4转染的间充质干细胞(CXCR4-MSC)和未转染的间充质干细胞(Null-MSC).于注射后各时间点活体示踪MSC分布情况、裸鼠肝功能、生存率、组织病理学改变和肝细胞增殖情况.结果:CXCR4-MSC高表达CXCR4基因和CXCR4蛋白,肝衰竭裸鼠肝脏SDF-1α水平升高,与正常裸鼠相比有统计学差异.体外迁移实验证实CXCR4-MSC比Null-MSC具有向SDF-1α更好的迁移能力.体内活体成像显示移植后5 d CXCR4-MSC主要定植在肝脏,而Null-MSC在肝脏和脾脏都有定植.高定植率使得转染组裸鼠比未转染组裸鼠肝细胞受损更轻且具有更长的生存期,同时转染组裸鼠肝细胞增殖明显多于未转染组,两者有统计学差异.我们的实验证实转染CXCR4基因的骨髓间充质干细胞能够更好地促进肝再生.结论:基因修饰使骨髓间充质干细胞过表达CXCR4基因能够促进干细胞在肝脏的定植,改善肝功能,提高肝细胞的再生和裸鼠的生存率,为干细胞移植治疗肝功能衰竭提供了更广阔的应用途径.

关键词：急性肝衰竭细胞移植间充质干细胞趋化因子受体4 基因修饰

HSV-gD-IL-21 DNA疫苗免疫效应及抗鼠眼角膜HSV-1感染的初步研究

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现代免疫学 2010年第4期30卷 282-287页

作者：胡凯何向锋窦骏袁献温余方流胡卫华赵枫殊刘春生东南大学医学院病原生物学和免疫学系东南大学附属中大医院南京210009

构建共表达HSV-1型gD和鼠源性IL-21DNA疫苗,探讨其是否能诱导动物免疫应答以及抵抗眼角膜HSV-1的感染。PCR扩增HSV-1gD和IL-21基因,分别定向插入载体pRSC中,构建DNA疫苗pRSC-gD-IL-21,对其进行鉴定后再分别以pRSC-gD-IL-21、pRSC-gD、p... 详细信息

构建共表达HSV-1型gD和鼠源性IL-21DNA疫苗,探讨其是否能诱导动物免疫应答以及抵抗眼角膜HSV-1的感染。PCR扩增HSV-1gD和IL-21基因,分别定向插入载体pRSC中,构建DNA疫苗pRSC-gD-IL-21,对其进行鉴定后再分别以pRSC-gD-IL-21、pRSC-gD、pRSC免疫小鼠3次,间隔2周,末次免疫2周后检测血清抗体、IL-4及IFN-γ水平,特异性脾细胞增殖反应以及CTL、NK细胞杀伤活性。同时评价小鼠对病毒攻击角膜的免疫保护作用。经测序、酶切和RT-PCR鉴定后表明,pRSC-gD-IL-21中目的基因在细胞内成功转录表达。与对照鼠相比,该疫苗在鼠体内产生了较强的特异性抗体、IL-4及IFN-γ、特异性脾细胞增殖反应、CTL及NK细胞杀伤活性均增强,同时疫苗使小鼠产生了较强的针对眼角膜HSV-1感染免疫保护作用。结果显示,pRSC-gD-IL-21疫苗能诱导小鼠产生较强的免疫应答及针对HSV-1眼部感染的免疫保护作用。

关键词：单纯疱疹病毒1型 IL-21 DNA疫苗糖蛋白D 单纯疱疹病毒性角膜炎

猪骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养的比较蛋白质组学研究

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中华实验外科杂志 2014年第10期31卷 2131-2134页

作者：顾劲扬施晓雷袁献温张悦肖江强丁义涛南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆研究所 210008

目的比较猪骨髓间充质干细胞（MSCS）与原代肝细胞构建共培养体系前后肝细胞内蛋白质表达谱的差异.方法体外建立肝细胞与MSCS最适共培养体系.流式细胞仪分选共培养肝细胞）,并设立肝细胞、MSCS单纯培养组作为对照.采用双向凝胶电泳分... 详细信息

目的比较猪骨髓间充质干细胞（MSCS）与原代肝细胞构建共培养体系前后肝细胞内蛋白质表达谱的差异.方法体外建立肝细胞与MSCS最适共培养体系.流式细胞仪分选共培养肝细胞）,并设立肝细胞、MSCS单纯培养组作为对照.采用双向凝胶电泳分离后,将差异蛋白点进行胶内原位切割、酶解后,获得肽质指纹谱.并通过Western blot技术进一步验证.结果经质谱鉴定出34个蛋白点,Western blot检测证实囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）、白细胞介素（IL）-6、人高迁移率族蛋白（HMG）-1变化水平与蛋白质组结果基本一致.结论这些功能蛋白的差异表达可能与MSCS和原代肝细胞体外共培养下肝细胞特异性功能改善、细胞生存时间延长、免疫调节存在必然联系.

关键词：猪肝细胞骨髓间充质干细胞共培养蛋白质组

骨髓间充质干细胞诱导肝细胞耐受肝功能衰竭血清细胞毒性的研究

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中华实验外科杂志 2014年第2期31卷 308-311页

作者：顾劲扬施晓雷袁献温张悦肖江强丁义涛南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科 210008

目的探讨与骨髓间充质干细胞（BMSCs）共培养的肝细胞可耐受慢加急性肝功能衰竭患者血清的细胞毒性,以及共培养细胞对肝功能衰竭血清的肝功能支持作用.方法收集慢性乙型肝炎慢加急性肝功能衰竭患者血清（n=18）及正常志愿者血清（n=18... 详细信息

目的探讨与骨髓间充质干细胞（BMSCs）共培养的肝细胞可耐受慢加急性肝功能衰竭患者血清的细胞毒性,以及共培养细胞对肝功能衰竭血清的肝功能支持作用.方法收集慢性乙型肝炎慢加急性肝功能衰竭患者血清（n=18）及正常志愿者血清（n=18）.建立猪肝细胞与BMSCs最适共培养体系.实验分为4组：肝功能衰竭血清单纯肝细胞培养组（Hep-F）、肝功能衰竭血清共培养组（Co-F）、正常人血清单纯肝细胞培养组（Hep-N）和正常人血清共培养组（Co-N）.血清浓度依次为10％、20％、40％、60％、80％和100％.培养24 h后收集上清液检测白蛋白水平和肝细胞周期确定最合适的肝功能衰竭血清浓度.观察细胞生长状态、超微结构及细胞活力.分别检测60％浓度血清培养组超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷氨酰胺（GLN）和胆碱酯酶（CHE）水平.更换为含10％胎牛血清的完全培养基继续培养24 h,收集Hep-FB、Co-FB、Hep-NB和Co-NB组上清液,重复检测SOD、LDH、GLN和CHE水平.结果共培养组肝细胞在60％浓度的肝功能衰竭血清中贴壁数量最多,呈岛状聚集生长.肝细胞表达白蛋白水平最佳,G2～S期细胞比例升至32.08％,细胞内超微结构接近正常,细胞活力较对照组明显改善.Co-F组SOD、GLN和LDH水平与Co-N组之间差异无统计学意义（P＞0.05）,仅CHE水平有所下降,但与Hep-F组比较显著提高.Co-FB组LDH、GLN、CHE活性较Hep-F组有显著改善.结论与BMSCs共培养的肝细胞可耐受中高浓度慢加急性肝功能衰竭血清的细胞毒性,有效维持肝细胞功能.

关键词：肝细胞生物人工肝骨髓间充质干细胞共培养