检索结果-南通市图书馆

作者：袁晓峰厦门大学

学位级别：硕士

经济的全球化，技术革命的日新月异，已经使全世界的经济环境发生了深刻的变化。面对市场竞争日益激烈，客户需求瞬息万变，国际竞争压力越来越大。如何解决产品积压，进行成本控制和提高消费者的满意度等等，成为摆在每一位卷烟工作者... 详细信息

经济的全球化，技术革命的日新月异，已经使全世界的经济环境发生了深刻的变化。面对市场竞争日益激烈，客户需求瞬息万变，国际竞争压力越来越大。如何解决产品积压，进行成本控制和提高消费者的满意度等等，成为摆在每一位卷烟工作者面前的难题，要想有效解决这些问题，必须要求卷烟企业引入新的管理思想和现代化管理手段来改变传统的管理模式，提高企业的管理水平，才能在激烈的市场竞争中取得优势。本文通过分析卷烟企业的特点及行业面临的困难，指出推进ERP的应用是卷烟企业的必然选择。此外，文章还对卷烟企业ERP的实施方法进行了一些粗浅的探讨。最后得出结论：只要树立正确的理念，运用科学、合理的实施方法，ERP的应用一定能成为烟草行业实现经济转型的有效切入点。文章的内容如下：第一章：ERP概述．阐述了ERP、供需链等概念，介绍了ERP的特点、作用以及ERP的发展过程和发展趋势。第二章：ERP是新世纪中国企业管理的基石。总结了中国发展ERP的经验和教训，指出ERP应用是新世纪中国企业的必由之路第三章：推进ERP的应用是卷烟企业的必然选择。介绍卷烟行业特点和现状，对卷烟企业推进ERP的紧迫性和必要性进行分析，并总结了卷烟企业在ERP应用的现状和存在的问题。第四章：卷烟企业ERP项目的实施方法研究。对卷烟企业ERP项目的实施方法进行探讨性研究，总结了一些卷烟企业在实施中的经验和教训。第五章：MRPII／ERP应用的实例分析。通过对华美卷烟有限公司实施MRPII的具体分析，进一步加深对MRPII／ERP系统及实施过程的了解，并列举了卷烟企业MRPII／ERP系统的一些特点。

关键词： ERP 卷烟企业应用

重庆市普通高校公共体育课程教学质量评价与对策研究

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重庆市普通高校公共体育课程教学质量评价与对策研究

作者：袁晓峰西南大学

学位级别：硕士

随着我国高等教育的发展,学生的主体作用日益突显,学生评价作为一种新的评价方式受到越来越多的重视。而当前重庆市大多数高校或没有专门针对体育课程的教学质量测评表。为有效地促进重庆市普通高校公共体育课程教学质量,本研究在以重... 详细信息

随着我国高等教育的发展,学生的主体作用日益突显,学生评价作为一种新的评价方式受到越来越多的重视。而当前重庆市大多数高校或没有专门针对体育课程的教学质量测评表。为有效地促进重庆市普通高校公共体育课程教学质量,本研究在以重庆理工大学、重庆师范大学、重庆医科大学、西南大学、重庆交通大学、重庆大学、西南政法大学、重庆工商大学、重庆邮电大学等高校的公共体育课程评价情况为调查对象,深入研究影响重庆市普通高校公共体育课程教学质量评价的因素,并在从探索性因子分析到验证性因子分析,构建体育学习满意度结构模型,并以此提出针对性对策。结果表明:1、当前重庆市普通高校公共体育课程学生学习在教学效果与学习目标之间还存在一定的差距,学习目标的完成度上还有待进一步提高。学生对体育知识的获得情况不太理想,还有待于进一步提高。学生对学习愉快体验程度、身体素质提高方面的期望值与感知值之间具有明显的差距。学生对学习愉快体验程度的期望值并没有得到满足,提示学生高校公共体育课程学习愉快体验程度还有待于进一步提高。学生身体素质提升的期望值并没有得到满足。另外研究表明:学生对公共体育课程学习价值感知和学习预期仍然有比较巨大的提升空间,学生对目前学习环境的忠诚度不高。2、本研究从探索性因子分析到验证性因子分析,得到了教学效果、学习价值感知、学习预期、学习满意度、学习环境、学习忠诚和课程口碑等7个维度拟合程度较好的体育学习满意度结构模型。该模型由7个维度和24个条目组成,模型中学习满意度对其他6个维度的影响最大。3、根据构建的体育学习满意度结构方程模型的启示,本研究提出开展多维度高校公共体育课程教学质量评价工作、加大对学生体育学习满意度的重视程度和建立多维度互评渠道,进一步完善高校公共体育课程教学质量评价系统等针对重庆市高校公共体育课程教学质量评价发展对策。

关键词：重庆市普通高校公共体育课程教学质量评价对策研究

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基于SERCOS的开放式数控系统研发

基于SERCOS的开放式数控系统研发

作者：袁晓峰西南交通大学

学位级别：硕士

数控系统就是指通过控制传统机械加工机床来进行高精密度，复杂曲面零件加工的计算机系统。SERCOS(SErial Real-time COmmunication System)接口是数字控制器与伺服驱动器间的串行实时通信总线。是当今唯一的用于运动控制的开放式接口... 详细信息

数控系统就是指通过控制传统机械加工机床来进行高精密度，复杂曲面零件加工的计算机系统。SERCOS(SErial Real-time COmmunication System)接口是数字控制器与伺服驱动器间的串行实时通信总线。是当今唯一的用于运动控制的开放式接口国际标准(IEC61491)和我国的国家标准(GB／T18473-2001)，得到众多厂商得广泛支持。以工业计算机为硬件平台，以Windows操作系统为软件平台，以SERCOS总线为数字伺服驱动接口的数控系统以其强大的功能、良好的人机界面、可扩展性、可移植性、可操作性、互交换性、可重用性、易维护性而成为开放式数控系统发展的趋势之一。而且，开放式的体系结构便于在工厂环境内实现计算机集成制造系统(CIMS)，易于实现工业信息化。本文根据当今世界数控系统的发展潮流，研制开发采用SERCOS接口技术的基于Windows平台的开放式数控系统。对开发过程中出现的一些难点问题，如：译码、刀具补偿、速度控制、插补和实时控制技术等提出了合理的解决方法。

关键词： SERCOS Windows 开放式数控系统

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TJ银行“担保圈”问题的风险管控研究

TJ银行“担保圈”问题的风险管控研究

作者：袁晓峰东华大学

学位级别：硕士

近年来,我国商业银行“担保圈”风险频频爆发,其中较为典型的是2014年6月29日发生的33家上市公司26亿股权遭到冻结,其中有9个公司股东是因为为其他借款企业提供了连带担保而承担责任,由于借款企业经营不善,无力偿还贷款,最终发展到其股... 详细信息

近年来,我国商业银行“担保圈”风险频频爆发,其中较为典型的是2014年6月29日发生的33家上市公司26亿股权遭到冻结,其中有9个公司股东是因为为其他借款企业提供了连带担保而承担责任,由于借款企业经营不善,无力偿还贷款,最终发展到其股权被银行或其他相关金融机构冻结。在担保圈问题频繁发生的情况下,人们开始认识到金融机构存在潜在的授信风险,同时这些风险对于经济波及地区产生了潜在的波动风险。目前担保圈风险已经成为金融机构需要迫切解决的问题,如果不能有效的解决信用风险问题,将会对整个金融机构的信贷资产安全造成威胁,同时对我国经济市场发展也会造成巨大的威胁。因此对于担保圈风险,金融机构以及监管部门必须开始重视,提前预防风险,并将风险把控在可控范围内。本文以TJ银行为研究对象,基于商业银行视角,对担保圈的风险问题进行管理控制研究。在研究过程中积极提取有效数据,综合担保圈风险分各项特征进行对比分析,对商业银行如何面对担保圈风险进行全面研究,发现担保圈风险成因以及特点,为商业银行规避担保圈风险提供有效建议。首先,本文需要了解担保圈成因,为论文研究构建理论基础。担保圈形成的原因来自于政府的过度刺激鼓励,造成了企业对当前市场经济发展形式的盲目判断,没有结合自身发展实际,一昧的扩大企业生产规模,忽略了企业资金链情况,造成企业运营资金紧张。当前我国仍处于社会主义初级发展阶段,企业融资市场还处在发展的初级阶段,向商业银行贷款依然是企业融资最为主要的来源。银行为了满足政府机构监管要求,并为了能够有效规避风险,在实际放贷过程中特别重视第二还款来源,可是,对于融资的企业而言,商业银行的这一偏好使得其通过抵押方式获得的贷款相对减少,企业要想获得更多的贷款金额,就只能将目光放在了担保贷款上面。另一方面担保贷款对于贷款方信息审核要求相较于其他贷款途径来说相对宽松,这就造成了在保证圈贷款中出现了信息不对称现象,银行在担保圈的识别上面存在一定困难。另一方面,本文对担保圈的利弊方面进行了分析,首先肯定了担保圈机制出现之初的积极作用,担保圈机制的产生增加了企业融得资金的可能性,在一定程度上缓解了我国现阶段中小企业融资难的问题,同时也可以提高投资人在投资过程中的资产安全问题,利用担保圈上市相较于其他途径上市的企业来说,更加具有信用优势。但是随着担保圈的发展,其弊端也逐渐暴露出来,其中对于我国市场经济发展影响较大的是由于担保圈的信息不对称因素造成了担保圈在银行授信中的担保作用虚化,造成了贷款违约概率增加,无形中增加了商业银行信贷风险。其次,在实践操作方面,本文以TJ商业银行为研究对象,对其面临的担保圈风险以及其目前控制担保圈风险的方法进行了分析介绍,即通过对担保圈的识别和风险预测,对担保圈的风险进行等级评定,对于不同等级的担保圈风险,采用不同的处理方法来控制信贷风险。最后,在宏观层面,本文根据上文分析的担保圈风险成因,从政策建议方面对如何有效防范担保圈风险问题再次发生提供了相关建议,还从商业银行的角度分析了如何有效控制和化解担保圈风险。

关键词：商业银行担保圈风险控制

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微图形化技术在印刷电子材料的应用研究

微图形化技术在印刷电子材料的应用研究

作者：袁晓峰苏州大学

学位级别：硕士

本论文主要进行了激光图形化技术在印刷电子材料中的应用研究。近年来，随着新型有机半导体材料的不断涌现，以低成本的印刷方式制作电子器件成为可能，诸如电子纸、柔性显示屏、柔性发光二极管等具有柔软特性的电子产品不断推出，印刷... 详细信息

本论文主要进行了激光图形化技术在印刷电子材料中的应用研究。近年来，随着新型有机半导体材料的不断涌现，以低成本的印刷方式制作电子器件成为可能，诸如电子纸、柔性显示屏、柔性发光二极管等具有柔软特性的电子产品不断推出，印刷电子也被业界称为下一代半导体制造技术。其中柔性透明导电膜作为印刷电子材料的一个重要课题，得到了广泛研究，以低成本的印刷工艺生产柔性透明导电膜成为科研人员的一个目标。然而现今的印刷电子工艺，如丝网印刷、喷墨打印和凹版柔性印刷都无法同时实现高效率、低成本和高精度的印刷制作。本论文将精密光刻微图形、纳米压印技术和Ag浆刮涂技术相结合，实现了由微细金属网格栅构成的柔性透明导电膜的制作。首先，对能够保证图形高精度拼接和高效率光刻的飞行频闪平铺曝光技术和Z轴校正技术进行了分析，对图形化设备的图形输入器件DMD在相干光照明下的相位调制特性进行了理论和实验研究，发现DMD的微镜偏转角误差（±1o）对图形化设备的能量利用率有很大影响。利用激光图形化设备制作了透明导电膜所需的电路图形的精密光掩模板，其线宽为2.5μ m。研究了厚胶曝光工艺，采用铸模技术得到柔性PDMS压印模板，实验表明用负胶母版二次铸模得到的PDMS模板的雾度（8%）要低于正胶模板一次铸模（19%）。最后，采用紫外固化纳米压印技术在以PET为基底的UV胶上压印出沟槽图形，用Ag浆刮涂技术将纳米Ag填入沟槽中得到微细金属网格透明导电膜，其表面电阻为3Ω/。在刮涂Ag浆的实验中，通过增加沟槽的深度和UV胶表面的亲水性，可使得更多的Ag浆刮入到沟槽内，从而提高了导电膜的导电率。本论文利用纳米压印技术和Ag浆刮涂技术，实现了金属网栅柔性透明导电膜的高效率、低成本和高精度的制作，探索了印刷电子制作的基本工艺流程，为实现图形化设备在印刷电子的应用，以及为进一步研究印刷电子工艺提供了技术工艺基础。

关键词：图形化印刷电子柔性透明导电膜纳米压印 Ag浆刮涂

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抗冻混凝土的制备及性能研究

抗冻混凝土的制备及性能研究

作者：袁晓峰重庆大学

学位级别：硕士

引气作为提高混凝土抗冻性能的一种重要措施,通过控制拌和物含气量的方式来控制混凝土的抗冻性能。但抗冻混凝土在应用过程中仍存在两方面问题:一是提高含气量来提高抗冻性与保持强度之间的矛盾;二是混凝土含气量的损失,造成混凝土实体... 详细信息

引气作为提高混凝土抗冻性能的一种重要措施,通过控制拌和物含气量的方式来控制混凝土的抗冻性能。但抗冻混凝土在应用过程中仍存在两方面问题:一是提高含气量来提高抗冻性与保持强度之间的矛盾;二是混凝土含气量的损失,造成混凝土实体含气量低于设计值,抗冻性能降低。本文从混凝土制备的角度出发,在研究引气剂对混凝土性能影响规律的基础上采用改变W/B、掺合料、搅拌时间三种优化方式对混凝土气孔结构进行优化,同时探讨了生产工艺、施工条件对混凝土含气量、坍落度及经时损失的影响。揭示的基本规律如下:（1）引气剂掺量在0～0.06%范围内,对C30、C40的影响规律一致:随引气剂掺量增加,新拌混凝土的含气量提高,坍落度增大,混凝土抗压强度、弹性模量降低,折压比增大。掺入引气剂能显著提高混凝土的抗冻性能,有效抑制抗冻混凝土的早期收缩开裂且抗开裂性能随引气剂掺量增加而增强。（2）W/B在0.33～0.51范围内,混凝土含气量随W/B增大而先升高后降低,W/B为0.39时含气量最大,坍落度随W/B增大而持续增大。随W/B增大,混凝土抗压强度和弹性模量降低,抗冻性能降低,气孔平均孔径增大,气孔间距系数先减小后增大,W/B为0.39时,气孔间距系数最小。（3）粉煤灰、矿粉无论单掺或双掺均会降低新拌混凝土的含气量。掺量在0～30%范围内,坍落度随矿粉掺量增加而减小,随粉煤灰掺量增加而先减小后增大,粉煤灰掺量为10%时坍落度最小;力学性能随粉煤灰掺量增加而持续降低,随矿粉掺量增加而先升高后降低,矿粉掺量为10%时力学性能最佳。粉煤灰、矿粉无论单掺或双掺均会提高混凝土的抗冻性能,细化气孔孔径,降低气孔间距系数且以单掺30%粉煤灰效果最显著。（4）搅拌时间在80s40s范围内,随搅拌时间延长,混凝土的含气量先升高后降低,C30、C40含气量最大时对应的搅拌时间分别为120s、100s;坍落度随搅拌时间延长而先增大后减小,搅拌时间为100s时混凝土坍落度最大。搅拌时间对混凝土力学性能无太大影响。搅拌时间为120s时,混凝土抗冻性能最佳,C30、C40的抗冻等级均达到F300。随搅拌时间延长,气孔平均孔径减小,气孔间距系数先减小后增大,搅拌时间为120s时气孔间距系数最小。（5）混凝土的初始含气量、初始坍落度随减水剂掺量增加而提高;使用聚羧酸减水剂的混凝土初始含气量、含气量经时损失大于萘系减水剂。二次添加减水剂能有效延长混凝土的施工可操作时间,提高混凝土的含气量。混凝土在二次添加减水剂后是否出现泌水主要受第二次添加减水剂掺量的影响,混凝土强度主要受第一次添加减水剂掺量的影响。

关键词：含气量冻融循环抗冻性气孔结构参数

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基于RFID的定位方法研究

基于RFID的定位方法研究

作者：袁晓峰昆明理工大学

学位级别：硕士

近年来,无线网络技术高速发展,其应用范围越来越广,应用场合越来越多,正变得无处不可及,于是“物联网”、“情境感知服务”等概念相继提出。人们开始越来越希望在任何时间、任何地点对各个物体进行信息的获取与处理。RFID(Radio Frequen... 详细信息

近年来,无线网络技术高速发展,其应用范围越来越广,应用场合越来越多,正变得无处不可及,于是“物联网”、“情境感知服务”等概念相继提出。人们开始越来越希望在任何时间、任何地点对各个物体进行信息的获取与处理。RFID(Radio Frequency Identification)即射频识别,具有非接触性、抗干扰性强、定位的速度快、识别距离远、成本低等特性。由于上述优越特性使得RFID定位这个分支得到了越来越多的关注,渐渐被认为将成为未来主流的定位技术之一。在现有的RFID定位技术中,LANDMARC系统最典型,其他方法,基本上都是在LANDMARC系统上进行一定的修改。LANDMARC定位系统关键的创新就在于首次提出了参考标签的概念,并将其成功运用到RFID室内定位系统中,得到了较好的定位精度。由于使用了大量参考标签来代替RFID阅读器,于是定位成本大大下降,使RFID定位成为一种在经济上有可行性的定位方案。但是其定位范围过小,如果进行大范围的定位依旧要使用大量的RFID读写器,整套定位系统的组建成本就会相当高,失去经济效益上的可行性。针对现有的RFID定位方法只适合室内小范围定位,大范围定位成本非常高无较大可行性,且技术过于复杂的问题,本文提出了一种新RFID定位方法。使用一个阅读器天线布置在定位区域的中心位置,然后按一定角速度转动。根据读回的RSSI (Received Signal Strength Indicator接收信号强度)与转动的角度之间的数据,使用最大值法求得角度。然后,根据读回的RSSI值,以及通过蒙特卡罗实验预先得到的RSSI值与距离的关系,求得距离,从而实现定位。此种方案由于使用一个阅读器,与一个天线,大大节约了成本,同时,相对于现有的RFID定位方法,该方法也要简单。仿真结果表明,最大值法可以求得方位,但是误差过大。针对这个问题,本文提出一种改进的方法,即现有小波去噪处理阅读器读回的数据,然后再采用最大值求角度与方位。仿真结果表明,该改进方法大大改善了求方位的精度,初步满足室外或者是室内大范围定位的要求。

关键词： RFID 小波去噪 RSSI 定位对数距离路径损耗模型

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科技型中小企业初创期营销策略研究

科技型中小企业初创期营销策略研究

作者：袁晓峰华中科技大学

学位级别：硕士

科技型中小企业在初创期时制定的营销策略，是该时期企业战略规划中最重要的一部分，营销策略的好坏直接关系到科技型中小企业创业的成败。中小企业在初创期由于自身没有品牌，资金短缺，没有固定的客户群体，没有管理经验，再加上市场... 详细信息

科技型中小企业在初创期时制定的营销策略，是该时期企业战略规划中最重要的一部分，营销策略的好坏直接关系到科技型中小企业创业的成败。中小企业在初创期由于自身没有品牌，资金短缺，没有固定的客户群体，没有管理经验，再加上市场竞争强等原因，创业过程是极其艰难的，在初创期为自己制定合适的营销策略，有效的将自己的产品销售出去，打开市场，公司就有了一个好的开始，创业成功的可能性就大大增强了。本文以科技型中小企业为研究对象，采用理论研究和实地调研的研究方法，重点分析了科技型中小企业在初创期营销的重要性及困难，结合现在比较流行的营销模式，探讨适合初创期科技类中小企业的营销模式以及在制定营销策略时应该注意的问题，并以具体案例对各种营销模式进行了实例论证。本文主要内容包括：首先分析初创期科技型中小企业的特点，分析该类企业营销的重要性及困难所在。其次分析中小企业现在流行的各种营销方法和模式，并分析各种营销模式的优缺点，对科技型中小企业的营销策略提出自己的建议。再次，调研武汉电力系统高压检测设备类企业的营销模式，重点以WHSW公司为例，对各种营销模式进行实战分析以验证我们的建议。

关键词：科技型中小企业初创期营销模式

大坝安全监测资料分析若干问题研究——万安电厂典型坝段监测资料分析

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大坝安全监测资料分析若干问题研究——万安电厂典型坝段监测资料...

作者：袁晓峰南昌大学

学位级别：硕士

本文以江西万安水电站大坝安全监测为主要研究对象并参考了其他工程实例，以监控诸如变形、渗流、滑坡、裂缝等方面的安全性能为研究目的，对多年监测数据进行了数据处理、模型建立、监控与反演等问题进行了探讨。统计模型是大坝安全... 详细信息

本文以江西万安水电站大坝安全监测为主要研究对象并参考了其他工程实例，以监控诸如变形、渗流、滑坡、裂缝等方面的安全性能为研究目的，对多年监测数据进行了数据处理、模型建立、监控与反演等问题进行了探讨。统计模型是大坝安全监控中应用最为广泛的一种模型。但建立统计模型的回归方法有多种，这些回归方法各有其特点和适用性;因此，有比较地选择分析模型，对监测资料分析的准确性、系统性具有重要影响。本文结合万安电站大坝的实际特点，对多元回归、逐步回归、偏最小二乘回归进行了综合比较，为万安电站大坝变形监测选择了基于偏最小二乘回归的统计模型并编制了计算机程序。异常值是大坝安全监测中普遍存在且不可避免的数据成分，对数据分析的精度有恶劣的影响。小波分析在异常值检测、去噪等方面有独到之处。本文对小波分析在异常值去除、去噪、分离效应量三方面进行了有益的探索;实例表明，小波分析非常适合大坝安全监测数据的后处理，相比其他方法而言，小波分析耗时少，精度高，是一种十分便捷的分析工具;特别在去除异常值方面，大大减轻了监测人员的工作量，提高了后续研究的精度。突变理论是一门研究不连续现象的定性分析理论，在分析不连续现象方面有着显著优势。突变现象在大坝安全领域十分普遍，如渗流破坏、滑坡、坝基失稳等。本文主要从突变模型的选择、势函数建立方面进行了一些思考和探讨，并建立了基于多年监测数据的某测压管水位的折迭突变模型，算例分析结果与工程实际是相吻合的。 FLAC是进行拉格朗日分析的显式有限差分程序。本文探讨了利用FLAC建立确定性模型和混合模型的方法，并以某土坝渗流稳定分析为研究对象，建立了测压管水位的确定性模型，进一步建立混合模型。利用BP神经网络建立了大坝变形监控模型，实例表明其预测效果好于统计模型。并对BP神经网络在参数反演方面的应用进行研究，通过对某土坝渗透系数的反演分析，提高了确定性模型的精度，有一定的应用前景。最后对万安电站典型坝段多年监测资料进行了系统分析。结果表明，该坝段工作状况良好、运行正常。

关键词：大坝安全监测偏最小二乘回归小波分析突变理论 FLAC3D神经网络

利用Gateway技术构建组织特异启动子及在诱导型多能干细胞分化研究中的应用

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利用Gateway技术构建组织特异启动子及在诱导型多能干细胞分化研...

作者：袁晓峰中山大学

学位级别：硕士

胚胎干细胞是来源于早期胚胎内细胞团(Inner cell mass,ICM)或桑椹胚的一种多潜能细胞[1]，能在体外自我更新，在适当的条件下可以分化为成体的各种类型的组织细胞[2]，是当前生物学研究的热点，在发育生物学、遗传学、毒理学和药物筛... 详细信息

胚胎干细胞是来源于早期胚胎内细胞团(Inner cell mass,ICM)或桑椹胚的一种多潜能细胞[1]，能在体外自我更新，在适当的条件下可以分化为成体的各种类型的组织细胞[2]，是当前生物学研究的热点，在发育生物学、遗传学、毒理学和药物筛选研究等领域中发挥着日益重要的作用[3]。2007年底，日本和美国两个科研小组应用病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4[4]（或者是Nanog和Lin28[5]）四个基因转导至人的成纤维细胞，使其逆向分化为具有胚胎干细胞特性的多潜能干细胞，即为诱导的多潜能干细胞（iPSCs细胞，induced pluripotent stemcells）[6-8]。iPSCs细胞具有和胚胎干细胞类似的生物学特性，通过这个技术建立病人特异的胚胎干细胞系，可以彻底的解决细胞治疗中的免疫排斥问题，而且绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，为疾病发生发展的机理研究、疾病特异性药物的筛选和细胞移植治疗提供了很好的研究模型。胚胎干细胞以无限增殖能力和全能性等优点，为组织工程种子细胞的重要潜在来源[5]。α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，αSMA)是细胞内六种肌动蛋白亚类之一，在所有真核细胞中的表达都高度保守[6]。编码它的基因是相对局限于在血管平滑肌细胞中表达的少数几个基因之一，公认是血管平滑肌细胞表型转化的标志[7]。大量的实验证明胚胎干细胞可以特异分化三胚层的细胞类型，为将来的细胞替代治疗带来了希望。然而，目前的胚胎干细胞分化研究都存在一个问题：难于纯化目标细胞群。解决的方法主要有以下两种，例如使用目的细胞特异抗体标记的方法，或者构建组织细胞特异启动子携带报告基因的载体转染细胞（分化以后所得到的目的细胞会带有报告基因），最终都可以通过流式细胞分选技术收集目的细胞。后者较前者还具有优势，就是将携带报告基因的细胞移植到体内后，能够方便的观察细胞在体内的迁移、分化以及对移植效率进行有效的评估，为移植治疗的研究提供了有力的工具，同时利用这种细胞可以进行体外的药理、毒理和化学生物学等方面的研究。转基因就是将外源基因导入生物体或者细胞内，使宿主的遗传性状发生改变。通过转基因技术使干细胞携带标记基因，可以在体内实验中作为示踪剂对移植的细胞进行跟踪;体外实验中，标记基因便于干细胞的观察。鉴于胚胎干细胞和转基因技术的重要性，因此，如何能将外源基因高效地转入胚胎干细胞并能在不影响其生物学特性的情况下持续稳定表达就显得十分必要。目前，胚胎干细胞的转基因方法有很多种[9]，包括物理方法（如电穿孔[10]）、化学方法（如Lipofectamine2000[11]）和病毒转导[12]等三大类。由于胚胎干细胞呈克隆状生长，生长环境比较复杂，通过传统的转基因方法很难获得表达外源基因的均一性细胞群体，较理想的方法多是通过慢病毒载体介导而完成的。传统的慢病毒质粒构建技术需要进行酶切、连接等过程，操作繁琐复杂。近年来有科学家建立了一种更为灵活通用的克隆方法—Gateway技术，Gateway技术是利用λ噬菌体特异性结合位点，在Clonase的作用下整合到宿主***的基因组中的一种新的通用型克隆技术[13]。利用Gateway技术构建慢病毒载体,只需要在目的基因两端加上特异性的15bp大小的att结合位点,通过两种Clonase作用下的BP和LR结合反应,即可将目的基因导入载体中,其整合率可达到100%。而且去除了酶切、连接过程,可以避免假阳性的出现。因其操作方便,Gateway技术近年来在基因工程中的应用已越来越广泛[14]。有鉴于此，本实验的主要研究思路是，本研究先构建携带小鼠αSMA和αMHC基因启动子的报告基因载体，然后以人诱导型多能干细胞为模型，经诱导分化形成类胚体后，进一步添加报告基因载体，再特异性向平滑肌细胞分化，对所得到的荧光细胞进行鉴定和分析，并观察向平滑肌细胞的分化。因此，本研究主要分为以下两个部分：第一部分：利用多位点Gateway技术构建系列慢病毒载体。第二部分：携带组织特异启动子的慢病毒载体转导人诱导型多潜能细胞及其诱导分化的实验研究。第一部分利用多位点Gateway技术构建αSMA和αMHC基因启动子慢病毒载体1.1目的利用Gateway技术构建αSMA和αMHC基因启动子慢病毒载体，将载体质粒线性化后瞬时转染C2C12细胞系，并且用免疫荧光染色检测基因的表达。目的在于通过操作简便的Gateway技术快速、高效的构建系列的慢病毒载体。1.2方法1.2.1利用Gateway技术中涉及到的LR结合反应，将入门克隆PDONRTM221-dTomato/PDONRTM221-hrGFP和PDONR

关键词： Gateway慢病毒转导血管平滑肌细胞诱导型多能干细胞