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基于TaqMan探针荧光PCR检测致泻性大肠埃希氏菌

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中国食品学报 2021年第3期21卷 274-281页

作者：袁慕云许龙岩柯碧霞陈瑶广州海关技术中心广州510623 广东省疾病预防控制中心广州510440 南方医科大学广州510515

建立快速检测致泻性大肠埃希氏菌的(DEC)方法,根据DEC的uidA(GenBank:JQ068101.1)、bfpB(Sequence:NG_034726.1)、eaeA(GenBank:AJ579305.1)、LT(GenBank:M17873.1)、ST(GenBank:M18346.1)、Stx1(GenBank:FR875155.1)、Stx2(GenBank:AB030484.1)、ipaH(GenBank:JQ638638.1)、aggR(GenBank:Z32523.1)设计引物和探针,建立基于TaqMan探针荧光PCR检测方法。用uidA基因检测所有DEC,A体系4个基因bfpB、eaeA、LT、ST检测EPEC和ETEC,B体系4个基因ipaH、Stx1、Stx2、aggR检测EIEC、STEC和EAEC,两个体系探针的5′端分别标记FAM、VIC、TET和ROX。试验结果表明,两个体系扩增效率89.6%~102.2%,线性相关系数R2在0.965~0.999范围,可准确鉴别出25株DEC型别,而70株非DEC扩增结果阴性。本研究所建立方法的特异性强,可准确检测EPEC、ETEC、EIEC、STEC和EAEC。

关键词：致泻大肠埃希氏菌荧光PCR 致病因子检测

基于TaqMan探针四重荧光PCR检测甲型、乙型、丙型副伤寒和伤寒沙门菌

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卫生研究 2017年第2期46卷 298-302页

作者：许龙岩袁慕云孙薇柯碧霞洪烨广东检验检疫技术中心广州510623 广州机场检验检疫局广东省疾病预防控制中心

目的建立基于Taq Man探针四重荧光PCR检测甲型、乙型、丙型副伤寒和伤寒沙门菌的方法。方法根据甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi A,SPA)、乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B,SPB)、丙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi... 详细信息

目的建立基于Taq Man探针四重荧光PCR检测甲型、乙型、丙型副伤寒和伤寒沙门菌的方法。方法根据甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi A,SPA)、乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B,SPB)、丙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi C,SPC)和伤寒沙门菌(Salmonella typhi,ST)的特异序列分别设计引物SPAP、SPBP、SPCP和STP,在探针的5'端分别标记TET、ROX、FAM、HEX,建立基于Taq Man探针四重荧光PCR检测方法。结果 SPAP、SPBP、SPCP和STP分别扩增出5株SPA、4株SPB、7株SPC和11株ST,而其他血清型沙门菌和17株非沙门菌扩增结果阴性。SPAP、SPBP、SPCP和STP扩增效率分别为84.5%、101.8%、92.4%和90.9%,线性相关系数(R^2)分别为0.996、0.975、0.996和0.984。结论建立的方法特异性高、敏感性强,可用于SPA、SPB、SPC和ST的特异性检测。

关键词：四重荧光PCR 甲型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌丙型副伤寒沙门菌伤寒沙门菌食品检测

微孔板试剂盒检测婴幼儿配方奶粉中生物素方法探讨

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食品科技 2013年第2期38卷 271-273页

作者：张旺邹志飞袁慕云阳静广东检验检疫技术中心广州510623

研究如何提高微生物法测定生物素的准确性和稳定性。对微生物法测定生物素的关键控制点、主要影响因素进行探讨分析。采用IFP微孔板试剂盒检测婴幼儿配方奶粉中生物素含量,相对传统方法具有操作方法简便、结果准确、重复性好的特点。

关键词：微生物法生物素微孔板

DiversiLab系统沙门氏菌分子分型评价

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食品科学 2012年第3期33卷 203-206页

作者：许龙岩袁慕云林文丽张旺焦红广东出入境检验检疫局技术中心食品实验室广东广州510623

目的:评价DiversiLab(DVL)系统对沙门氏菌(SA)的分型能力。方法:用rep-PCR技术为原理的DVL系统对进出口食品中分离的44株SA进行分子分型,并与脉冲场凝胶电泳(PFGE)结果比较,探讨DVL对SA的种群分类能力和分辨率。结果:44株SA经rep-PCR分... 详细信息

目的:评价DiversiLab(DVL)系统对沙门氏菌(SA)的分型能力。方法:用rep-PCR技术为原理的DVL系统对进出口食品中分离的44株SA进行分子分型,并与脉冲场凝胶电泳(PFGE)结果比较,探讨DVL对SA的种群分类能力和分辨率。结果:44株SA经rep-PCR分型分成22个群,分离自不同国家、不同食品中的相同血清型SA分布在同一个群,而且菌株之间相似性非常高。在rep-PCR结果中分在同一个群中的SA,在PFGE结果中除SA2和SA15外,其他菌株之间相关性较低。结论:DVL在SA的种群的分类能力上优于PFGE,但分辨率低于PFGE。

关键词：沙门氏菌 DiversiLab系统 rep-PCR PFGE 分子分型

PCR-焦磷酸测序检测单核细胞增生李斯特氏菌研究

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中国食品卫生杂志 2013年第3期25卷 201-205页

作者：许龙岩袁慕云唐勤阳静相大鹏广东出入境检验检疫局技术中心广东广州510623 南方医科大学广东广州510515

目的建立结合PCR-焦磷酸测序检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。方法根据单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因设计扩增引物和测序引物,特异地扩增目的片段,再制备单链模板,在测序引物引导下进行焦磷酸测序,通过测序结果与GenBank中的hly... 详细信息

目的建立结合PCR-焦磷酸测序检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。方法根据单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因设计扩增引物和测序引物,特异地扩增目的片段,再制备单链模板,在测序引物引导下进行焦磷酸测序,通过测序结果与GenBank中的hly基因序列的比对进行鉴定。结果扩增引物和测序引物表现出良好的特异性,16株单核细胞增生李斯特氏菌菌株均扩增出大小249 bp的DNA片段,焦磷酸测序结果与hly基因序列100%匹配,而阴性对照菌株均未扩增出DNA条带,焦磷酸测序结果为阴性。结论建立的方法特异性高,是快速从DNA序列水平上检测单核细胞增生李斯特氏菌的有效手段。

关键词： PCR-焦磷酸测序单核细胞增生李斯特氏菌 DNA碱基序列 hly基因

TaqMan探针双重荧光PCR法检测副溶血性弧菌

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食品科学 2013年第18期34卷 263-266页

作者：许龙岩袁慕云曹际娟凌莉广东出入境检验检疫局广东广州510623 辽宁出入境检验检疫局辽宁大连116001

目的:建立同时检测副溶血性弧菌(VP)和其毒力基因的方法。方法:根据VP的toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应扩增体系,进行特异性、敏感性实验,并用建立的方法检测从广东地区和辽宁地区进... 详细信息

目的:建立同时检测副溶血性弧菌(VP)和其毒力基因的方法。方法:根据VP的toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应扩增体系,进行特异性、敏感性实验,并用建立的方法检测从广东地区和辽宁地区进出口食品中分离的VP菌株的毒力基因分布情况。结果:VP标准菌株和3株从食物中毒病人中分离株均出现toxR基因和tdh基因扩增曲线,而31株包括溶藻弧菌、单增李斯特菌等弧菌属和肠杆菌科的菌株扩增结果呈阴性;敏感性实验结果表明,VP浓度与Ct值有很好的反向的线性关系,toxR和tdh线性方程的R2分别为0.999、0.997,最低检测浓度达到3.6×102CFU/mL;检测食品中分离的37株VP只出现toxR基因扩增曲线,未见tdh基因扩增曲线,表明37株VP分离株均未带tdh毒力基因。结论:建立的方法特异性好、灵敏度高,可用于食品中VP的特异性及毒力基因检测。

关键词：副溶血性弧菌 toxR基因 tdh基因 TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应检测食品

速冻水饺中金黄色葡萄球菌的DiversiLab分型研究

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食品科技 2012年第9期37卷 311-314页

作者：刘静宇郑晶凌莉易敏英袁慕云席静广东出入境检验检疫局技术中心广州510623 福建出入境检验检疫局技术中心福州350003

目的:对速冻水饺中分离的20株金黄色葡萄球菌进行DiversiLab分型,研究其基因特征和聚类分布。方法:采用DiversiLab自动分型系统扩增金黄色葡萄球菌基因组中广泛分布的重复序列,然后在Agilent2100自动生物分析仪上对扩增片段进行微流体... 详细信息

目的:对速冻水饺中分离的20株金黄色葡萄球菌进行DiversiLab分型,研究其基因特征和聚类分布。方法:采用DiversiLab自动分型系统扩增金黄色葡萄球菌基因组中广泛分布的重复序列,然后在Agilent2100自动生物分析仪上对扩增片段进行微流体电泳分离,并使用DiversiLab Software软件实时分析和处理数据,对20株金黄色葡萄球菌进行分子分型。结果:DiversiLab分型系统将20株金黄色葡萄球菌分为13个型别,其中P1型包含菌株L17、L14、L11,P2型包含L16、L12、L19、L4菌株,P3型包含菌株L3、L18、L13,其余10株金黄色葡萄球菌的每一个菌株被分为一个单独的型别。结论:20株金黄色葡萄球菌从基因型来看有一定的聚集性,可能来自相近的污染源。同时也有一些金黄色葡萄球菌菌株之间的基因型差异较大,遗传学上关系较远,可能来自不同的污染途经。Diversilab自动化分型技术方便快捷,是监控食品及其生产企业细菌性污染的有力工具。

关键词：金黄色葡萄球菌 DiversiLab自动分型系统细菌基因组重复序列PCR

出入境动物源性食品中单增李斯特菌的多位点序列分型分析

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食品科学 2016年第12期37卷 212-216页

作者：刘二龙袁慕云邓建英幸芳吕英姿蒋原薛峰邵景东许龙岩黄埔出入境检验检疫局广东广州510730 广东出入境检验检疫局广东广州510623 广州市番禺质量技术监督检测所广东番禺511400 江苏出入境检验检疫局江苏南京210001

对出入境动物源性食品中分离的单增李斯特菌进行多位点序列分型（mutilocus sequence typing,MLST）分析,了解其序列型分布特点及不同菌株之间的亲缘关系。提取单增李斯特菌基因组DNA,选择其7个管家基因进行聚合酶链式反应扩增并测序。... 详细信息

对出入境动物源性食品中分离的单增李斯特菌进行多位点序列分型（mutilocus sequence typing,MLST）分析,了解其序列型分布特点及不同菌株之间的亲缘关系。提取单增李斯特菌基因组DNA,选择其7个管家基因进行聚合酶链式反应扩增并测序。将测序结果截成标准序列的长度后上传到MLST数据库进行比对分析,获得7个管家基因的等位基因谱和序列分型编码,并将结果采用不加权算术平均组对（unweighted pair group method using arithmetic averages,UPGMA）法进行聚类分析。89株单增李斯特菌共获得51个STs,其中26个为新获得的STs（STnew1-STnew26）;数量最多的5个STs为ST8（9.0%）,ST121（9.0%）、ST7（5.6%）、ST87（5.6%）及新发现的STnew3（7.8%）;其中ST456、ST34、ST343、ST19、ST517、ST201、ST98、ST330和ST73为在国内首次获得。采用UPGMA算法得到的进化树可将89株菌株分为3大类群,分类的结果与单增李斯特菌血清学家系分类结果一致。MLST结果对了解出入境动物源性食品中分离的单增李斯特菌的亲缘关系及流行病学溯源有重要意义。

关键词：单增李斯特菌多位点序列分型亲缘关系

进出口食品中单核细胞增生李斯特菌脉冲场凝胶电泳分型研究

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卫生研究 2010年第4期39卷 509-512页

作者：许龙岩袁慕云刘静宇赵贵明皱志飞凌莉张旺焦红广东出入境检验检疫局技术中心食品试验室广州510623 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所

目的研究进出口食品中分离的单核细胞增生李斯特菌(LMO)之间分子分型特征和遗传相关性。方法参照美国PulseNet推荐的LMO脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准方法,用限制性内切酶AscⅠ酶切LMO染色体DNA进行PFGE试验。用BioNumerics软件对不同地区... 详细信息

目的研究进出口食品中分离的单核细胞增生李斯特菌(LMO)之间分子分型特征和遗传相关性。方法参照美国PulseNet推荐的LMO脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准方法,用限制性内切酶AscⅠ酶切LMO染色体DNA进行PFGE试验。用BioNumerics软件对不同地区分离的LMO进行比对,分析菌株之间的相似度。结果 24株LMO分成20种PFGE型,菌株之间的相似度在44.45%～100%。来源于加拿大的LMO16、美国的LMO18、丹麦的LMO13,丹麦的LMO7和顺德的LMO22,广州的LMO21和山西的LMO8,分别有相同的PFGE型,相似度达到100%。结论进出口食品中分离的LMO在整体上表现出较大的遗传多样性,但部分菌株有一定程度的相关性。

关键词：单核细胞增生李斯特菌脉冲场凝胶电泳分子分型食品安全