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猪源致病性大肠杆菌生物被膜建模、氟喹诺酮类药物和木糖醇对生物膜的体外作用研究

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猪源致病性大肠杆菌生物被膜建模、氟喹诺酮类药物和木糖醇对生物膜的体外作用研究

作者：虞惠贞姜中其浙江大学动物科学学院

目的大肠杆菌可引起仔猪腹泻、增重减缓甚至生长抑制,常给养猪业常造成重大经济损失。当形成生物被膜时,生物被膜为细菌提供保护性环境,将提高其耐药性。本试验在构建仔猪大肠杆菌生物被膜模型基础上,开展浮游大肠杆菌与生物被膜菌的耐... 详细信息

目的大肠杆菌可引起仔猪腹泻、增重减缓甚至生长抑制,常给养猪业常造成重大经济损失。当形成生物被膜时,生物被膜为细菌提供保护性环境,将提高其耐药性。本试验在构建仔猪大肠杆菌生物被膜模型基础上,开展浮游大肠杆菌与生物被膜菌的耐药对比并考察木糖醇对生物被膜的抗粘附作用及其与氟喹诺酮类药物联用时对生物膜的体外抑制作用,旨在为仔猪大肠杆菌耐药性研究及临床上更合理地治疗生物被膜大肠杆菌感染提供依据。方法与结果(1)采用卡尔加里生物被膜发生装置定量法和12孔细胞培养板内置载体片定性法,比较不同培养基、不同培养时间和不同浓度葡萄糖、不同材质(聚氯乙烯、硅胶破片和普通盖玻片)的载体片对大肠杆菌生物膜形成的影响,通过光学显微镜比较三种载体上生物膜形态,结果表明,在LB培养基,37℃,PVC材料作为载体片,培养6天后可得成熟的大肠杆菌生物被膜。(2)采用MBEC生物被膜发生装置,应用结晶紫染色法对120株临床分离的致仔猪腹泻的大肠杆菌生物被膜形成能力进行了筛选,发现猪源致病性大肠杆菌生物被膜形成率高达83.3%。(3)采用CLSI标准,用96孔板微量稀释法测定临床分离大肠杆菌生物被膜菌、浮游菌和脱膜菌对氟喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类等19种抗菌药物的敏感性,结果显示,19种抗菌药物对已形成生物被膜的分离株的MBIC和MBEC均比相应的浮游菌的MIC以及MBC高2-32倍。(4)通过分离菌落形成单位计数法和激光扫描共聚焦显微镜的观察,结果表明,与阳性对照相比,经0.5%、2.5%、5%木糖醇处理后的菌落数均表现出显著差异性(P<0.05)。(5)通过0.5%、2.5%、5%的木糖醇处理,检测氟喹若酮类药物对大肠杆菌生物膜的MBIC和MBEC,结果提示:与无木糖醇处理组相比,经过0.5%、2.5%、5%木糖醇处理后,环丙沙星和恩诺沙星对大肠杆菌的MBIC以及MBEC均显著降低(P<0.05);不同浓度木糖醇对仔猪大肠杆菌成熟生物被膜的破坏试验中,与无木糖醇处理组相比,经过0.5%、2.5%、5%木糖醇处理后,环丙沙星和恩诺沙星的MBIC以及MBEC也显著下降(P<0.05)。结论猪源致病性大肠杆菌临床分离株形成生物被膜后耐药性显著增高,氟喹诺酮类药物单独使用或与木糖醇联合应用可干扰该菌生物被膜的形成和破坏已经形成的生物被膜,二者具有协同作用。

关键词：仔猪病原性大肠杆菌生物被膜耐药性抗菌药物木糖醇

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腹泻仔猪病原性大肠埃希菌毒力因子分布与耐药性分析

中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：虞惠贞姜中其浙江大学动物科学学院

【目的】大肠杆菌可引起仔猪腹泻、增重减缓甚至生长抑制,常给养猪业常造成重大经济损失。当形成生物被膜时,生物被膜为细菌提供保护性环境,将提高其耐药性。本试验在构建仔猪大肠杆菌生物被膜模型基础上,开展浮游大肠杆菌与生物被膜菌... 详细信息

【目的】大肠杆菌可引起仔猪腹泻、增重减缓甚至生长抑制,常给养猪业常造成重大经济损失。当形成生物被膜时,生物被膜为细菌提供保护性环境,将提高其耐药性。本试验在构建仔猪大肠杆菌生物被膜模型基础上,开展浮游大肠杆菌与生物被膜菌的耐药对比并考察木糖醇对生物被膜的抗粘附作用及其与氟喹诺酮类药物联用时对生物膜的体外抑制作用,旨在为仔猪大肠杆菌耐药性研究及临床上更合理地治疗生物被膜大肠杆菌感染提供依据。【方法与结果】(1)采用卡尔加里生物被膜发生装置定量法和12孔细胞培养板内置载体片定性法,比较不同培养基、不同培养时间和不同浓度葡萄糖、不同材质(聚氯乙烯、硅胶破片和普通盖玻片)的载体片对大肠杆菌生物膜形成的影响,通过光学显微镜比较三种载体上生物膜形态,结果表明,在LB培养基,37℃,PVC材料作为载体片,培养6天后可得成熟的大肠杆菌生物被膜。(2)采用MBEC生物被膜发生装置,应用结晶紫染色法对120株临床分离的致仔猪腹泻的大肠杆菌生物被膜形成能力进行了筛选,发现猪源致病性大肠杆菌生物被膜形成率高达83.3%。(3)采用CLSI标准,用96孔板微量稀释法测定临床分离大肠杆菌生物被膜菌、浮游菌和脱膜菌对氟喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类等19种抗菌药物的敏感性,结果显示,19种抗菌药物对已形成生物被膜的分离株的MBIC和MBEC均比相应的浮游菌的MIC以及MBC高2-32倍。(4)通过分离菌落形成单位计数法和激光扫描共聚焦显微镜的观察,结果表明,与阳性对照相比,经0.5%、2.5%、5%木糖醇处理后的菌落数均表现出显著差异性(P<0.05)。(5)通过0.5%、2.5%、5%的木糖醇处理,检测氟喹若酮类药物对大肠杆菌生物膜的MBIC和MBEC,结果提示:与无木糖醇处理组相比,经过0.5%、2.5%、5%木糖醇处理后,环丙沙星和恩诺沙星对大肠杆菌的MBIC以及MBEC均显著降低(P<0.05);不同浓度木糖醇对仔猪大肠杆菌成熟生物被膜的破坏试验中,与无木糖醇处理组相比,经过0.5%、2.5%、5%木糖醇处理后,环丙沙星和恩诺沙星的MBIC以及MBEC也显著下降(P<0.05)。结论猪源致病性大肠杆菌临床分离株形成生物被膜后耐药性显著增高,氟喹诺酮类药物单独使用或与木糖醇联合应用可干扰该菌生物被膜的形成和破坏已经形成的生物被膜,二者具有协同作用。

关键词：仔猪病原性大肠杆菌生物被膜耐药性抗菌药物木糖醇

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2013年第1期39卷 98-104页

作者：张静姜中其虞惠贞吴永福蒋明君浙江大学动物科学学院杭州310058

为了探索仔猪大肠埃希菌性腹泻的发病机制、大肠埃希菌毒力因子变迁以及与耐药性可能存在的关系,在直肠棉拭采集浙江省规模猪场腹泻仔猪病料,经细菌分离纯化、形态学结合PCR鉴定以及小鼠致病性试验得到124株病原性大肠埃希菌基础上,应用... 详细信息

为了探索仔猪大肠埃希菌性腹泻的发病机制、大肠埃希菌毒力因子变迁以及与耐药性可能存在的关系,在直肠棉拭采集浙江省规模猪场腹泻仔猪病料,经细菌分离纯化、形态学结合PCR鉴定以及小鼠致病性试验得到124株病原性大肠埃希菌基础上,应用PCR分析其毒力因子,采用K-B法及耐药性专用软件Whonet测定并分析其对抗菌药物的耐药性,最后,通过Logistic分析分离株毒力因子与耐药性的相关性。结果表明:菌毛阳性分离株(F4+和F41+)占总菌株数的7.26%(9/124),首次检测到毒力因子EAST1、PAA和AIDA-I,其中EAST1检出率高达19.68%(24/124),而PAA和AIDA-I阳性率较低,分别为4.84%(6/124)和2.42%(3/124);分离株对苯唑西林(100%)、复方新诺明(97.6%)、利福平(97.6%)、多西环素(96%)、羧苄西林(93.5%)、氨苄西林(93.5%)、阿莫西林(93.5%)耐药严重;链霉素与氨苄西林(75.45%)、恩诺沙星(65.45%)、复方新诺明(78.18%)、庆大霉素(63.64%)、多西环素(96%)、氟苯尼考(50.91%)间交叉耐药明显。分离菌株100%呈多重耐药,其中以14～16耐药最多(43.31%);阿莫西林/克拉维酸(P=0.046)和多西环素的耐药性(P=0.020)与大肠埃希菌黏附与脱落病变eae(*** attaching and effacing)基因显著相关,多黏菌素B(P=0.004)和氯霉素的耐药性(P=0.013)与EAST1显著相关。结合以往资料,我们认为大肠埃希菌毒力因子已发生明显改变,耐药性更趋严重,且二者之间存在相关性,需深入研究以更好制订大肠埃希菌病有效防控措施。

关键词：腹泻仔猪病原性大肠埃希菌毒力因子耐药性相关性

三重real-time PCR同步检测黄牛、水牛和牦牛成分

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食品科学 2021年第20期42卷 280-285页

作者：吴姗张明哲方云陈哲张荃孙超沈旭芳虞惠贞尹文秀张晓峰浙江省检验检疫科学技术研究院浙江杭州310016

为准确快速地鉴定黄牛、水牛和牦牛的成分,研发具有这3种牛特异性的引物和探针,并建立单重、双重和三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法,同步检测上述3种牛的成分。单重real-time PCR检测... 详细信息

为准确快速地鉴定黄牛、水牛和牦牛的成分,研发具有这3种牛特异性的引物和探针,并建立单重、双重和三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法,同步检测上述3种牛的成分。单重real-time PCR检测时,3种牛的检测灵敏度均为0.025 ng/μL;双重real-time PCR检测时,两两组合的引物探针含量比例为1∶1时,黄牛的检测灵敏度降低至0.1 ng/μL,而水牛和牦牛仍为0.025 ng/μL;对三重real-time PCR检测体系进行优化,当黄牛、水牛和牦牛3组引物探针的含量比例为3∶3∶2时,检测灵敏度最佳,黄牛和水牛的检测灵敏度可达到0.1 ng/μL,而牦牛的灵敏度仍可达到0.025 ng/μL。但上述双重和三重real-time PCR检测的灵敏度,是建立在3种牛的含量比例为1∶1∶1的情况下,若3种牛的比例差异较大,特别是黄牛和牦牛的含量比例差异较大时,如比例为9∶1时,含量低的成分会存在漏检。因此,在对整块肉的样品进行检测时,可采用三重real-time PCR的方法同步检测3种牛的成分;若样品可能为上述3种肉的为混合物,如肉糜、肉松等,则建议采用单重real-time PCR检测。

关键词：黄牛水牛牦牛三重real-time PCR

羽绒中DNA提取方法及鸭绒鹅绒成分的定量检测

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中国纤检 2016年第10期 98-103页

作者：吴姗虞惠贞任明兴方莹浙江省检验检疫科学技术研究院绍兴出入境检验检疫局

为提高用PCR法鉴定鸭绒鹅绒的准确度,提高羽绒中DNA的提取效率,优化了DNA提取方法;同时为了便于对羽绒制品的真伪鉴别,建立了羽绒中鹅绒鸭绒等的定量计算方法。通过比较5种前处理方法和4种抽提试剂盒及其组合间的抽提效率,建立最佳的抽... 详细信息

为提高用PCR法鉴定鸭绒鹅绒的准确度,提高羽绒中DNA的提取效率,优化了DNA提取方法;同时为了便于对羽绒制品的真伪鉴别,建立了羽绒中鹅绒鸭绒等的定量计算方法。通过比较5种前处理方法和4种抽提试剂盒及其组合间的抽提效率,建立最佳的抽提程序。利用荧光PCR定量的优势,建立了羽绒中的鹅绒鸭绒比例定量计算的方法,并将计算得到的值与预设的混合比例加以比较。经验证,本研究建立的鹅绒鸭绒等定量计算方法能准确反映含量变化的趋势,可作为一种有效的辅助手段对羽绒制品进行真伪甄别。

关键词：羽绒 DAN提取荧光PCR 定量检测真伪甄别

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基于近红外光谱的象牙鉴定

光谱学与光谱分析 2023年第8期43卷 2397-2406页

作者：吴姗张明哲虞惠贞陈哲尹文秀张荃沈旭芳孙超裘慧帅江冰张晓峰杭州海关技术中心浙江杭州310016

中国已经全面禁止了象牙交易,但象牙的走私并未因此而终止。对象牙及其制品的鉴定是打击走私一个重要环节。传统的形态学鉴定法,是基于横截面上施氏结构的有无,但有的象牙本身缺少特征纹路,有的则经过雕刻加工后纹路消失,这类样品往往... 详细信息

中国已经全面禁止了象牙交易,但象牙的走私并未因此而终止。对象牙及其制品的鉴定是打击走私一个重要环节。传统的形态学鉴定法,是基于横截面上施氏结构的有无,但有的象牙本身缺少特征纹路,有的则经过雕刻加工后纹路消失,这类样品往往无法鉴定。从分子生物学角度鉴定象牙具有更高准确性,象牙DNA含量极低,象牙中提取DNA的难度较大。已有学者采用光谱技术鉴定和区分象牙等材质,并表明采用拉曼光谱和近红外光谱的短波区域可以区分象牙及其类似物(其他动物牙齿)。采用近红外光谱的长波波段1000~1800 nm,通过建模的方式建立了象牙的鉴别方法。以非洲象(Loxodonta spp.)象牙、亚洲象(Elephas maximus)象牙、猛犸象(Mammuthus spp.)象牙为校正样品集,其他非象牙材质制品,包括抹香鲸(Physeter macrocephalus)牙、河马(Hippopotamus amphibius)牙,象牙果(Phytelephas macrocarpa),模仿成象牙的塑料制品等为验证样品集,采集了230件样品共383条近红外光谱信息。比较了象牙样品颜色和厚度等对光谱鉴定结果的影响,建议扫描具有该物质典型颜色部位,同时取样品厚度大于1 mm的部位进行扫描,否则易造成误判。基于象牙光谱4个较敏感波段,1160~1200、1430~1500、1680~1710和1720~1750 nm,以及SIMCA(soft independent modeling by class analogy)定性分析方法,建立象牙的鉴别模型。建模过程中,在平衡假阳性率和假阴性率后,推导出本模型的最佳主因子值为2和F值为0.21。采用所建立的模型鉴定样品,对象牙的识别准确率达到100%,对角制品、塑料仿制品以及象牙果仿制品等伪品的识别率也达100%,但对质地较相近的其他动物的牙齿,如野猪牙、抹香鲸牙等,则易错鉴为象牙,需要结合其他方法做进一步的鉴定。光谱模型鉴定方法具有无损、简便等特点,同时通过模型鉴别光谱图形较人为观察更加客观和高效,因此较适合作为监管部门现场执法用的快速查验初筛方法。

关键词：近红外光谱模型建立象牙鉴定

利用TaqMan微流控阵列同步检测多种动物源性成分

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2020年第2期46卷 189-200页

作者：虞惠贞侯寒黎尹文秀张荃孙超张明哲张晓峰苗丽吴姗浙江省检验检疫科学技术研究院杭州310012 钱江海关杭州310007 郑州海关技术中心郑州450003

利用TaqMan微流控阵列(TaqMan■array microfluidic card)技术,将24种(类)动物物种的实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)的引物探针集合在同一个阵列上,以实现多物种高通量同步检测,并对该方法的重复性、特异性和灵敏度进行验证。用变异系数(coefficient of variation,CV)表示一块阵列板内,同一物种成分检测的重复性。结果显示:66个CV值中,11个低于1%,15个大于2%,其余40个介于1%~2%之间,没有一个物种成分的CV值高于3%。P值显示的是不同阵列板间同一成分检测的重复性,22个物种成分的P值只有1个小于0.05,显示为板间存在差异,其他21种成分的板间差异均未达到显著水平。因此,本研究对多数物种成分的检测,不论板内还是板间都有较好的重复性。特异性检测中未发现TaqMan微流控阵列中出现假阳性的结果,但有2种成分的检测出现了假阴性。TaqMan微流控阵列的检测灵敏度没有高于单重荧光定量PCR,在22个检测样品中,10个物种成分检测的灵敏度降为原来的10%,1个甚至降低为原来的1%,其余11个灵敏度和单重荧光保持一致。总体而言,TaqMan微流控阵列技术在重复性、特异性和灵敏度方面都能满足物种成分真伪鉴定的需求,为同步鉴定多种动物源性成分提供了一种新的方法。

关键词： TaqMan微流控阵列动物源性成分同步检测

单核细胞增生李斯特菌和致病性弧菌的双重肽核酸原位荧光杂交检测

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2018年第6期44卷 659-666页

作者：吴姗李可方云楼成杰虞惠贞张明哲帅江冰张晓峰浙江省检验检疫科学技术研究院杭州310016

为了同步快速检测单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)和致病性弧菌,建立了它们的双重肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)原位荧光杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)检测方法。在用单重PNA探针分别检测单增李斯特菌... 详细信息

为了同步快速检测单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)和致病性弧菌,建立了它们的双重肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)原位荧光杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)检测方法。在用单重PNA探针分别检测单增李斯特菌和致病性弧菌的基础上,建立了可同步检测它们的双重PNA荧光检测方法,优化了适合这2种菌同步双重杂交的固相荧光原位杂交检测参数。在标记的荧光为FAM和Cy3的情况下,使用Leica DM 6000B荧光显微镜对4种荧光滤光模块I3、L5、N21和Y3的检测效果进行比较,结果表明:在进行双重荧光检测时,建议选择L5和Y3的组合分别观察绿色荧光和红色荧光。比较2种菌液体积比例对检测结果的影响表明:当比例从1∶1调至1∶9时,2种菌可同时在2个检测通道中被检测到;当比例调至1∶19时,量少的菌则很难被观察到。综上表明:2种PNA探针分别被标记上FAM和Cy3荧光后,可使用Leica DM 6000B荧光显微镜在L5和Y3滤镜模块下分别进行绿光和红光的观察。说明若选择合适的荧光及荧光滤光模块,可使用普通荧光显微镜完成单增李斯特菌和致病性弧菌的PNA-FISH同步检测。

关键词：双重肽核酸探针荧光原位杂交单核细胞增生李斯特菌弧菌

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暗色刺参的实时荧光PCR鉴定

中国海洋大学学报（自然科学版） 2022年第12期52卷 33-43页

作者：吴姗虞惠贞沈旭芳孙超张荃陈哲尹文秀张明哲张晓峰杭州海关技术中心浙江杭州310016

暗色刺参(Isostichopus fuscus)已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)目录。为精确辨别和有效保护该物种,作者进行了精准鉴定暗色刺参的实时荧光PCR方法的研究。在GenBank中收集暗色刺参及近似种海参的线粒体序列,使用海参... 详细信息

暗色刺参(Isostichopus fuscus)已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)目录。为精确辨别和有效保护该物种,作者进行了精准鉴定暗色刺参的实时荧光PCR方法的研究。在GenBank中收集暗色刺参及近似种海参的线粒体序列,使用海参的线粒体基因中细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(Cytochrome oxidase subunitⅠgene,COⅠ)进行实时荧光PCR中引物和探针的设计。根据收集到的17种海参的25条COⅠ序列,设计了2组具有暗色刺参特异性的引物探针组合I-fu-1和I-fu-2;同时根据暗色刺参实物测序得到的COⅠ序列,设计了引物探针I-fu-3~I-fu-6。实时荧光PCR检测结果显示:I-fu-1、I-fu-3、I-fu-4、I-fu-6仅在目标物种中检测到阳性,I-fu-2和I-fu-5则在墨西哥刺参(Isostichopus badionotus)中也检测到阳性;对纯暗色刺参样本的灵敏度(指在一次荧光PCR反应中能够检测到暗色刺参的最低浓度)检测显示,I-fu-4优于I-fu-1、I-fu-3和I-fu-6,可达到0.0008 ng/μL,因此认为I-fu-4是最佳的引物探针组合。利用I-fu-4对混合物中暗色刺参进行检测,在同属近似种墨西哥刺参含量高达99.9%,暗色刺参含量低至0.05%的混合样品中,暗色刺参的实时荧光PCR检测也显示了强阳性结果。本研究建立的鉴定方法具有高特异性和灵敏度的特性,有助于快速、精准地鉴定暗色刺参。

关键词：暗色刺参物种鉴定实时荧光PCR 濒危物种

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