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口蹄疫病毒3A基因在大肠杆菌中的表达

口蹄疫病毒3A基因在大肠杆菌中的表达

作者：薛青红西北农林科技大学

学位级别：硕士

口蹄疫是多种偶蹄动物(包括家畜和野生动物)的高度接触性病毒传染病，被国际兽疫局列为A类传染病之首，其感染动物后的主要危害是使家畜生产力下降和种畜经济价值丧失，对畜产品出口贸易造成严重影响。我们根据已有资料推测，3A基因可... 详细信息

口蹄疫是多种偶蹄动物(包括家畜和野生动物)的高度接触性病毒传染病，被国际兽疫局列为A类传染病之首，其感染动物后的主要危害是使家畜生产力下降和种畜经济价值丧失，对畜产品出口贸易造成严重影响。我们根据已有资料推测，3A基因可能是口蹄疫病毒的毒力决定簇，它具有高度保守性，其变异和部分缺失对病毒在牛体内的致弱和宿主嗜性发生改变起重要作用。本论文利用大肠杆菌原核表达系统，通过基因重组技术高效表达重组3A蛋白，为进一步研究3A蛋白的结构差异与病毒毒力、宿主嗜性等方面的相关作用打下基础，为FMDV多肽疫苗和基因疫苗的研制开发提供一些可借鉴的资料。本实验应用分子生物学技术，构建含FMDV 3A基因的重组原核表达载体pProEX-3A和pProEX-3A。实验中，提取口蹄疫病毒RNA，利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆FMDV 3A基因，纯化后与载体相连，转化感受态细胞，筛选鉴定后提取质粒测定其序列。RT-PCR结果表明，扩增出符合预期分子量大小的DNA片段，经测序确定为FMDV 3A。序列分析后选取2株差异毒株进行大肠杆菌原核表达。利用聚合酶链式反应(PCR)在3A基因的两端引入BamH Ⅰ和XbaⅠ酶切位点。将3A基因克隆到用同样限制酶线形化的原核表达载体pProEX-HTb中，转化大肠杆菌BL21，经氨苄抗性筛选得到阳性克隆，命名为pProEX-3A和pProEX-3A，IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western bolt结果证实，大肠杆菌菌体不可溶性蛋白中富含3A蛋白，且此融合蛋白的分子量符合预期设计，说明3A蛋白在表达产物中以包涵体的形式存在，所表达的蛋白含量分别占菌体蛋白的29.2％和22.1％。

关键词：口蹄疫病毒 3A基因克隆大肠杆菌表达

猪源粪肠球菌的BIOLOG系统鉴定及其生物学特性

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中国兽医科学 2006年第11期36卷 876-879页

作者：薛青红刘燕杜昕波中国兽医药品监察所北京100081

利用BIOLOG自动微生物分析系统和传统鉴定方法对1株猪源粪肠球菌进行了鉴定,并对其生物学特性进行了系统研究。结果显示,2种鉴定方法的结果一致,与传统的鉴定方法相比,BIOLOG自动微生物分析系统更快捷、方便、高效,可快速为临床诊断和... 详细信息

利用BIOLOG自动微生物分析系统和传统鉴定方法对1株猪源粪肠球菌进行了鉴定,并对其生物学特性进行了系统研究。结果显示,2种鉴定方法的结果一致,与传统的鉴定方法相比,BIOLOG自动微生物分析系统更快捷、方便、高效,可快速为临床诊断和用药提供依据。生物学试验表明,本株粪肠球菌在液体和固体培养基内均可有效抑制大肠杆菌生长,从而维持肠道平衡;另外,该菌株可使培养液的pH值降低至3.69。上述结果为该菌株的进一步开发利用提供了理论支持。

关键词：粪肠球菌 BIOLOG自动微生物分析系统生物学特性

陕西省规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查

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中国动物检疫 2007年第1期24卷 34-35页

作者：刘业兵王晶钰薛青红邹敏中国兽医药品监察所北京100081 西北农林科技大学陕西杨凌7121002 青岛易邦生物工程有限公司 266032

2005年10月至2006年9月．我们对陕西省西安、宝鸡、汉中三市的部分发生繁殖障碍的规模化猪场（存栏母猪300头以上）就PRRS进行了流行病学调查，现报告如下。

关键词：流行病学调查猪繁殖与呼吸综合征规模化猪场陕西省繁殖障碍母猪

广西猪瘟流行毒与C-株疫苗毒gp55(E_2)主要抗原区DNA序列差异的比较

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2002年第1期30卷 79-84页

作者：张永国刘湘涛韩雪清张彦明薛青红中国农业科学院兰州兽医研究所西北农林科技大学畜牧兽医学院陕西杨陵712100 西北农林科技大学畜牧兽医学院

采用反转录 PCR(RT- PCR)和套式 PCR(nest Polym erase Chain Reaction,n PCR)扩增出 3株广西省近期 (1999～ 2 0 0 0年 )猪瘟流行野毒的 E2 基因 ,将其分别克隆于 PMD- 18T载体上并进行了核苷酸序列测定 ,根据 C株及 Brescia和 Alfort... 详细信息

采用反转录 PCR(RT- PCR)和套式 PCR(nest Polym erase Chain Reaction,n PCR)扩增出 3株广西省近期 (1999～ 2 0 0 0年 )猪瘟流行野毒的 E2 基因 ,将其分别克隆于 PMD- 18T载体上并进行了核苷酸序列测定 ,根据 C株及 Brescia和 Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行氨基酸序列推导 ,同时进行了同源性比较及 E2 糖蛋白结构的分析。结果表明 ,所测 3株 HCV E2 基因的长度均为 1170 bp,编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和部分跨膜序列 ,共由 384个氨基酸组成。3株流行毒的 E2 基因核苷酸序列同源性为 90 .10 %～ 98.5 4%,相应的氨基酸序列同源性为 89.5 9%～ 97.92 %。这 3株流行毒与 C-株兔脾组织毒 (疫苗种毒 ) E2 基因的核苷酸序列同源性为 82 .87%～ 83.99%,相应的氨基酸序列同源性为 86 .98%～ 90 .10 %,表明近期猪瘟流行毒与 C-株疫苗毒的 gp5 5蛋白之间存在一定的差异。

关键词：猪瘟 E2基因糖蛋白流行毒疫苗毒抗原 DNA序列分析比较研究广西

胸膜肺炎放线杆菌血清分型多重PCR方法的建立

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中国兽医杂志 2008年第2期44卷 28-29页

作者：朱良全薛青红蒋玉文康凯陈敏国家兽医微生物菌种保藏中心

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropne-unoniae)旧称副溶血性嗜血杆菌或猪胸膜肺炎嗜血杆菌.根据NAD依赖性,App划分为两个生物型,依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生长的生物Ⅰ型,无需NAD的生物Ⅱ型,致病菌主要为生物Ⅰ型[1].目... 详细信息

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropne-unoniae)旧称副溶血性嗜血杆菌或猪胸膜肺炎嗜血杆菌.根据NAD依赖性,App划分为两个生物型,依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生长的生物Ⅰ型,无需NAD的生物Ⅱ型,致病菌主要为生物Ⅰ型[1].目前依据荚膜多糖(capstllar polySaccharide,CP)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的抗原性[2]己分离鉴定出了15种血清型的App[3].已建立的多重PCR方法[4]将10株参考菌株分为5个血清群.

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 PCR方法血清分型多重胸膜肺炎嗜血杆菌烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生物型副溶血性

猪源支气管败血波氏杆菌新疆株的分离鉴定及生物学特性研究

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黑龙江畜牧兽医 2016年第6期 177-179页

作者：贺笋薛青红郝成武韩瑞何传雨何海新疆天康畜牧生物技术股份有限公司乌鲁木齐830013 中国兽医药品监察所北京100081

支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）是定殖在动物呼吸道黏膜纤毛上皮细胞的一类革兰氏阴性、需氧球杆菌，是引起猪萎缩性鼻炎的重要病原菌。支气管败血波氏杆菌易从患鼻炎的或者肺炎的仔猪或从无明显临床症状的呼吸... 详细信息

支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）是定殖在动物呼吸道黏膜纤毛上皮细胞的一类革兰氏阴性、需氧球杆菌，是引起猪萎缩性鼻炎的重要病原菌。支气管败血波氏杆菌易从患鼻炎的或者肺炎的仔猪或从无明显临床症状的呼吸道疾病的猪群中分离到，也是其他哺乳动物的病原或者潜在病原。在猪群中，断奶前仔猪感染支气管败血波氏杆菌可引起支气管肺炎和萎缩性鼻炎及继发感染其他呼吸道疾病。

关键词：支气管败血波氏杆菌猪萎缩性鼻炎分离鉴定生物学特性呼吸道疾病支气管肺炎新疆哺乳动物

外源性马立克氏病病毒荧光定量PCR检测方法的建立

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中国农业科学 2023年第20期56卷 4125-4136页

作者：苏佳赵炜刘丹王嘉白洪旭吴华伟薛青红陈晓春中国兽医药品监察所

【目的】为解决现有兽用生物制品外源性马立克氏病病毒(Marek’s disease virus, MDV)检验方法灵敏度低、检测时间长、鉴别性不强的问题，研究分别建立MDV血清1型(MDV serotype 1,MDV 1)和MDV血清3型(MDV serotype 3,MDV 3)毒株的实时... 详细信息

【目的】为解决现有兽用生物制品外源性马立克氏病病毒(Marek’s disease virus, MDV)检验方法灵敏度低、检测时间长、鉴别性不强的问题，研究分别建立MDV血清1型(MDV serotype 1,MDV 1)和MDV血清3型(MDV serotype 3,MDV 3)毒株的实时荧光定量PCR检测方法，用于禽用生物制品纯净性控制。【方法】从NCBI下载MDV 1、MDV血清2型(MDV serotype 1,MDV 2)和MDV 3各毒株UL19序列，进行核苷酸和氨基酸序列比对分析；分别针对MDV 1 CVI988毒株、MDV 3FC126毒株的UL19设计特异性引物和相应的Taqman探针，建立实时荧光定量PCR检测方法；分别构建相应的重组质粒作为阳性标准品，建立标准曲线，并评价所建立方法基因拷贝数检测的灵敏度；分别对其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2 SB-1毒株UL19的全长质粒及生产原材料(SPF鸡胚尿囊液、胚体、尿囊膜、鸡胚成纤维细胞)进行检测，评价检测方法的特异性；分别对600、60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006 PFU的CVI988毒株和FC126毒株进行检测，评价所建立方法检测活病毒粒子的灵敏度；分别以不同稀释度的阳性标准品质粒为模板，进行3次重复性检测，计算变异系数，分析所建立检测方法的可重复性。【结果】MDV UL19在同一血清型内核苷酸和推导的氨基酸同源性达99.99%，具有很高的保守性，在不同血清型间核苷酸同源性只有约75%，推导的氨基酸同源性只有约85%；分别建立了MDV 1和MDV 3两种实时荧光定量PCR检测方法；MDV 1检测方法标准曲线的扩增效率E=98.8%，相关系数R2=0.992，标准曲线方程Y=-3.351X+38.828(Y=Ct,X=lg(拷贝数))，MDV 3检测方法标准曲线的扩增效率E=95.0%，相关系数R2=0.998，标准曲线方程Y=-3.447X+36.496(Y=Ct,X=lg(拷贝数))；所建立的两种检测方法特异性好，MDV 1或MDV 3毒株扩增曲线良好，其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2SB-1毒株UL19的全长质粒及生产原材料未出现特异性扩增曲线；灵敏度高，MDV 1基因拷贝数检出限度为32.8拷贝/μL，至少可检出0.006 PFU的CVI988毒株，MDV 3基因拷贝数检出限度为10拷贝/μL，至少可检出0.006 PFU的FC126毒株；重复性好，MDV 1检测方法重复性试验的变异系数小于1%,MDV 3检测方法重复性试验的变异系数小于1.5%。【结论】所建立的实时荧光定量PCR检测方法可分别用于禽用生物制品中外源性MDV1、MDV3毒株的检测。

关键词：马立克氏病病毒实时荧光定量PCR 外源病毒检测