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PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立

中国人兽共患病学报 2008年第2期24卷 150-153页

作者：蔡亦红安徽医科大学合肥230032

目的本研究根据福氏志贺菌(Shigella lexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H,ipaH),设计了一对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段为435bp。对PCR的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对PCR扩增条件如引... 详细信息

目的本研究根据福氏志贺菌(Shigella lexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H,ipaH),设计了一对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段为435bp。对PCR的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速检测福氏志贺菌的稳定的PCR方法。该方法检测的灵敏度为可以检测到食品中7 ng/ml福氏志贺菌的基因组DNA。并且模拟检测食品中的细菌,结果很稳定。该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对食品中的志贺菌的诊检和监控。

关键词： PCR 微生物检验福氏志贺菌

microRNA干扰HPV16 E6基因对宫颈癌细胞顺铂敏感性影响的实验研究

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中国癌症杂志 2012年第12期22卷 892-897页

作者：孙璐蔡亦红安徽医科大学第三附属医院(合肥市第一人民医院)妇产科安徽合肥230061 安徽医科大学公共卫生学院卫生检验检疫系安徽合肥230032

背景与目的:宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤,其中80%的宫颈癌可以检测到HPV16基因。本研究观察HPV16 E6基因miRNA干扰对宫颈癌CaSki细胞顺铂敏感性的影响。方法:利用分子生物学技术,将本实验室构建的针对HPV16 E6基因的miRNA表达载体pcDNA ... 详细信息

背景与目的:宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤,其中80%的宫颈癌可以检测到HPV16基因。本研究观察HPV16 E6基因miRNA干扰对宫颈癌CaSki细胞顺铂敏感性的影响。方法:利用分子生物学技术,将本实验室构建的针对HPV16 E6基因的miRNA表达载体pcDNA 6.2-GW/EmGFPmiR,分别转染至CaSki细胞和C-33A细胞内。倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR测定HPV16 E6 mRNA变化,蛋白质印迹法(Western blot)检测转染前后E6蛋白表达,MTT法检测转染前后对宫颈癌细胞顺铂敏感性的影响。结果:经杀稻瘟菌素(blasticidin S HCl)选择培养液筛选2周后,将获得的稳定转染细胞分别命名为CaSki-M3和CaSki-N、C-33A-M3和C-33A-N。RT-PCR显示,CaSki-M3细胞内的E6 mRNA转录水平比未转染组降低了99%,E6蛋白的表达抑制率为87.5%。用0.005、0.05、0.5、5、50和500μg/mL的顺铂处理未转染CaSki和C-33A以及转染后CaSki-M3、CaSki-N、C-33A-M3和C-33A-N细胞,CaSki-M3细胞对顺铂的敏感性显著升高(P<0.01)。结论:HPV16 E6 miRNA有效下调HPV16 E6mRNA水平,抑制HPV16 E6蛋白的表达,可明显提高CaSki细胞对顺铂的敏感程度。

关键词： HPV16E6 microRNA 宫颈癌细胞顺铂

人巨细胞病毒感染小鼠大脑皮质细胞的体内外实验研究

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人巨细胞病毒感染小鼠大脑皮质细胞的体内外实验研究

作者：蔡亦红安徽医科大学

学位级别：硕士

目的：研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在体外可以增殖性感染新生小鼠大脑皮质细胞;在体内可以先天性潜伏感染小鼠大脑皮质细胞，并且可以被再激活。方法：体外试验：选用HCMV AD169株和3株HCMV临床分离株作为本次... 详细信息

目的：研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在体外可以增殖性感染新生小鼠大脑皮质细胞;在体内可以先天性潜伏感染小鼠大脑皮质细胞，并且可以被再激活。方法：体外试验：选用HCMV AD169株和3株HCMV临床分离株作为本次实验的毒种，并设立经高温灭活后HCMV AD169株对照组。对所有毒株进行50％组织细胞感染量(TCID)测定，然后在长成单层的Balb／c新生小鼠的大脑皮质细胞和HF细胞6孔板上分别接种相同滴度的病毒悬液0.1ml／孔。逐日镜下观察HCMV特征性细胞致病变效应(CPE)，同时采用PCR、RT-PCR、间接免疫荧光检测HCMV特异性基因IE和UL83的复制和蛋白表达，确定HCMV感染状态。分别在感染后第1、2、3、4、5天收集细胞及其培养上清液，采用TCID法检测被感染的新生小鼠大脑皮质细胞培养物上清的病毒滴度，每种病毒标本分两组，每组重复三次;并且在不同的时间点固定细胞片进行HCMV特异性早期蛋白和pp65蛋白免疫荧光检测;透射电镜观察大脑皮质细胞内HCMV病毒颗粒。体内试验：利用已建立的HCMV先天性潜伏感染的小鼠模型。试验分为三组：HCMV先天潜伏感染组、HCMV先天性潜伏感染再激活组(小鼠腹腔注射环磷酰胺150mg／kg，每6天1次，共3次)、HF细胞对照组小鼠。在各组小鼠达18～20月龄时，分别在各组随机选取小鼠5只。取HCMV先天性潜伏感染组、HCMV先天性潜伏感染再激活组小鼠和HF细胞对照组小鼠大脑皮质细胞与HF细胞建立共培养体系。利用PCR、RT-PCR、间接免疫荧光检测HCMV特异性基因IE和UL83的复制和蛋白表达。结果：体外试验研究：将TCID为1.7×10／ml HCMV AD169株病毒悬液接种在新生小鼠大脑皮质细胞培养物上，在感染后第2天可见神经细胞形态明显改变：镜下

关键词：人巨细胞病毒小鼠大脑皮质细胞先天性感染增殖性感染潜伏感染共培养小鼠模型

microRNA-155在弓形虫感染调节巨噬细胞极化中的作用

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中国血吸虫病防治杂志 2018年第6期30卷 652-655页

作者：蔡亦红刘静洪露安徽医科大学公共卫生学院卫生检验检疫系合肥230032 安徽医科大学第一附院高新院区肝胆胰外科安徽省合肥市第一人民医院口腔科

目的探讨弓形虫感染对宿主细胞内microRNA-155(miR-155)表达的影响及其对巨噬细胞极化的作用。方法利用miRNAs基因芯片检测弓形虫感染宿主细胞内miRNAs表达水平,应用实时定量聚合酶链反应技术(qPCR)检测miR-155表达水平。采用脂质体转... 详细信息

目的探讨弓形虫感染对宿主细胞内microRNA-155(miR-155)表达的影响及其对巨噬细胞极化的作用。方法利用miRNAs基因芯片检测弓形虫感染宿主细胞内miRNAs表达水平,应用实时定量聚合酶链反应技术(qPCR)检测miR-155表达水平。采用脂质体转染法将pEGFP-miR-155导入人巨噬细胞,利用流式细胞术检测转染效率。采用流式细胞术、qPCR、酶联免疫法检测弓形虫感染组、pEGFP-miR-155过表达组以及miR-155抑制组诱导巨噬细胞表面分子CD86及诱导型一氧化氮合酶(i NOS)和白细胞介素(IL)-12表达水平。结果基因芯片和q PCR检测结果显示,随着弓形虫感染时间的延长,miR-155表达量上升;pEGFP-miR-155转染宿主细胞的转染效率可达82.6%。弓形虫感染组和pEGFP-miR-155过表达组CD86表达水平显著高于对照组和miR-155抑制组,iNOS和IL-12基因表达量显著升高。结论弓形虫感染能够通过上调miR-155表达参与驱动人源巨噬细胞向M1型偏移。

关键词：刚地弓形虫 miRNA-155 巨噬细胞极化

体外研究人脐带血间充质干细胞对大鼠枯否细胞极化的影响

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安徽医科大学学报 2016年第1期51卷 41-46页

作者：李亮彭琼蔡亦红戴夫安徽医科大学第三附属医院(合肥市第一人民医院)消化内科合肥230001 安徽医科大学公共卫生学院合肥230032

目的采用脂多糖(LPS)诱导大鼠枯否细胞(KCs)发生极化改变,之后用人脐带血间充质干细胞(huM SCs)与LPS诱导的KCs在Transwell内共培养,以观察huM SCs对KCs极化偏移的调节作用。方法实验分为KCs组、KCs+LPS组、KCs+LPS+MSCs组。对各组的白... 详细信息

目的采用脂多糖(LPS)诱导大鼠枯否细胞(KCs)发生极化改变,之后用人脐带血间充质干细胞(huM SCs)与LPS诱导的KCs在Transwell内共培养,以观察huM SCs对KCs极化偏移的调节作用。方法实验分为KCs组、KCs+LPS组、KCs+LPS+MSCs组。对各组的白介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-10(IL-10)、白介素-6(IL-6)等上清因子采用ELISA法进行检测;诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg-1)、信号传导与转录激活因子3、6(STAT-3、STAT-6)、核因子kappaB(NF-κB)用Western bolt进行检测,同时用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)对以上结果进行验证。结果 KCs+LPS组促炎因子TNF-α、IL-6分泌增加,KCs+LPS+MSCs组抑炎因子IL-10、IL-4分泌增加;而Western blot检测表明,KCs+LPS组中iN OS升高,NF-κB p65入核增高;而KCs+LPS+MSCs组高表达Arg-1,同时pS TAT-3、pS TAT-6表达增加。结论 huM SCs能诱导已经发生M1极化的KCs向M2表型偏移,考虑可能与huM SCs分泌细胞因子有关,起到一种免疫调节作用,huM SCs调节巨噬细胞极化的分子机制可能与通过JAK-STAT信号转导通路有关。

关键词：枯否细胞人间充质干细胞免疫调节极化

我国弓形虫Chinese1优势虫株感染小鼠后不同组织生物金属元素留存测定

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中国动物传染病学报 2022年

作者：王艳玲蔡亦红安徽医科大学公共卫生学院卫生检验与检疫安徽医科大学病原生物学安徽省重点实验室安徽医科大学人畜共患病安徽高校省级重点实验室

通过观察中国流行的弓形虫Chinese1优势基因型强毒株Wh3、弱毒株Wh6感染小鼠后，体内不同组织中多种微量元素的留存情况，探讨弓形虫感染与宿主生物金属元素的相互关系及对机体代谢的影响。分别建立弓形虫Chinese1优势基因型强毒株Wh3... 详细信息

通过观察中国流行的弓形虫Chinese1优势基因型强毒株Wh3、弱毒株Wh6感染小鼠后，体内不同组织中多种微量元素的留存情况，探讨弓形虫感染与宿主生物金属元素的相互关系及对机体代谢的影响。分别建立弓形虫Chinese1优势基因型强毒株Wh3和弱毒株Wh6小鼠感染模型，运用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定感染小鼠不同组织内的生物金属元素水平。与对照组相比，实验组各组之间微量元素均出现改变，且Wh3和Wh6组之间的改变均不相同。弓形虫入侵能打破机体微量元素稳态，影响机体生物代谢功能。

关键词：弓形虫微量元素 Chinese 1基因型 ICP-MS

弓形虫Chinese 1基因型虫株感染对小鼠海马体细胞超微结构的影响

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安徽医科大学学报 2022年第10期57卷 1564-1568页

作者：王崇蔡亦红安徽医科大学公共卫生学院卫生检验与检疫合肥230032 安徽医科大学病原生物学安徽省重点实验室合肥230032 安徽医科大学人畜共患病安徽高校省级重点实验室合肥230032

目的观察弓形虫Chinese 1优势基因型TgCtwh3和TgCtwh6虫株对小鼠海马体细胞超微结构的影响。方法6周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为3组:对照组、TgCtwh3感染组、TgCtwh6感染组,每组6只。对照组腹腔注射无菌PBS;TgCtwh3感染组腹腔注射4000... 详细信息

目的观察弓形虫Chinese 1优势基因型TgCtwh3和TgCtwh6虫株对小鼠海马体细胞超微结构的影响。方法6周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为3组:对照组、TgCtwh3感染组、TgCtwh6感染组,每组6只。对照组腹腔注射无菌PBS;TgCtwh3感染组腹腔注射4000个TgCtwh3速殖子,饲养6 d;TgCtwh6感染组灌胃20个TgCtwh6包囊,饲养6周。所有动物经取材、制片,并用透射电子显微镜观察。结果与对照组相比,TgCtwh3感染组海马体细胞出现核皱缩坏死,胞质、轴突肿胀,细胞器消失,轴索断裂等病理变化。与对照组相比,TgCtwh6感染组海马体细胞出现线粒体肿胀、空泡化、嵴断裂消失、膜破裂,脂褐素沉积,高尔基体扩张等病理变化。结论TgCtwh3和TgCtwh6感染小鼠均出现海马体细胞超微结构的改变,TgCtwh3感染组多表现为不可逆的细胞坏死,而TgCtwh6感染组表现出线粒体结构破坏为主的慢性细胞损伤,这为探讨弓形虫脑病的致病机制奠定基础。

关键词：弓形虫海马超微结构小鼠

基于生物信息学构建肝癌免疫预后基因模型及初步验证

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华东师范大学学报（自然科学版） 2024年第4期 100-110页

作者：谢琳玎张远蔡亦红安徽医科大学公共卫生学院卫生检验与检疫学系合肥230032 安徽医科大学动物源性传染病安徽省重点实验室/人畜共患病安徽高校省级重点实验室合肥230032 苏州市吴江区儿童医院检验科江苏苏州215234

利用癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)和国际肿瘤基因组协作组(International Cancer Genome Consortium,ICGC)数据库收集肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者的RNA测序信息.首先,通过非负矩阵分解(non-negative matrix factorization,NMF)聚类方法和加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)筛选出参与HCC免疫反应机制的关键基因.利用套索(the least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)回归分析构建预后基因模型,并用基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)方法分析生物学功能.随后,对不同风险组患者使用单样本基因集富集分析(single sample genes set enrichment analysis,ssGSEA)评估两组间免疫浸润和相关功能差异.使用“RMS”R软件包结合独立危险因素构建列线图以预测患者的总体生存时间.最后,利用人类蛋白质图谱数据库(Human Protein Atlas,HPA)与实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)进行临床初步验证.总之,本文在风险评分的基础上整合患者临床特征,构建了一个可验证、可重复的列线图,为临床肿瘤患者的精准治疗提供可靠的参考.

关键词：生物信息学加权基因共表达网络分析肝癌免疫相关基因预后模型

弓形虫缓殖子期抗原1的原核表达及其多克隆抗体制备与初步应用

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中国病原生物学杂志 2023年第7期18卷 803-807页

作者：幸忆恩吴宏宇蔡亦红安徽医科大学公共卫生学院卫生检验与检疫安徽合肥230032 安徽医科大学病原生物学安徽省重点实验室安徽医科大学人畜共患病安徽高校省级重点实验室安徽医科大学第一临床医学院

目的对弓形虫缓殖子期抗原1(BAG1)基因进行优化、克隆、原核表达,表达产物纯化后免疫小鼠,制备BAG1多克隆抗体,评价重组蛋白的免疫原性,并观察BAG1在虫体内的定位。方法对bag1基因序列进行筛选和优化,利用生物信息学方法分析其编码蛋白... 详细信息

目的对弓形虫缓殖子期抗原1(BAG1)基因进行优化、克隆、原核表达,表达产物纯化后免疫小鼠,制备BAG1多克隆抗体,评价重组蛋白的免疫原性,并观察BAG1在虫体内的定位。方法对bag1基因序列进行筛选和优化,利用生物信息学方法分析其编码蛋白的氨基酸序列结构和功能,预测其免疫原性。将合成的pET28a(+)-bag1质粒转化至BL21感受态细胞中,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度l mmol/L,37℃诱导4 h,用HIS标签蛋白纯化试剂盒纯化表达蛋白。取纯化蛋白做SDS-PAGE凝胶电泳分析,用BCA法测定蛋白浓度。取7只BALB/c小鼠,取纯化的BAG1蛋白与等体积的弗氏佐剂按双推法混匀,皮下多点注射免疫小鼠,每鼠每次注射蛋白25μg(第一次使用弗氏完全佐剂,后两次均使用弗氏不完全佐剂,每隔两周免疫一次),末次免疫4 d后摘眼球取血,分离血清,以此为一抗,采用Western blot检测碱性条件下我国流行优势基因型Chinese 1虫株(TgCtwh6)速殖子向缓殖子转化及含有TgCtwh6包囊小鼠脑组织中的BAG1蛋白,间接免疫荧光(IFA)试验检测TgCtwh6虫株碱性诱导成为缓殖子情况。结果预测BAG1含有7个潜在抗原表位,具有良好的免疫原性。Western blot显示,BAG1多克隆抗体能识别在体外碱性培养基诱导的TgCtwh6和小鼠脑组织内形成的TgCtwh6虫株缓殖子;IFA结果显示,BAG1多克隆抗体能识别体外诱导的TgCtwh6缓殖子,且BAG1蛋白主要定位在弓形虫的胞质中。结论成功制备弓形虫BAG1多克隆抗体,该抗体能识别我国优势流行虫株的BAG1蛋白及缓殖子,为我国流行虫株的监测和鉴定提供了良好的手段。

关键词：弓形虫 Chinese 1基因型 BAG1 多克隆抗体