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粉尘螨新过敏原profilin蛋白克隆表达，免疫学鉴定及过敏反应机理的初步探究

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粉尘螨新过敏原profilin蛋白克隆表达，免疫学鉴定及过敏反应机理...

作者：蒋聪利深圳大学

学位级别：硕士

尘螨是一种全球性过敏性疾病中的的首要过敏原,有50%的过敏性疾病患者对尘螨表现出过敏反应。尘螨种类繁多,其中屋尘螨和粉尘螨是与人类过敏反应相关的两种重要致敏物种。据当前文献报道显示,粉尘螨中已发现有15种过敏原,分别为Der f1,2... 详细信息

尘螨是一种全球性过敏性疾病中的的首要过敏原,有50%的过敏性疾病患者对尘螨表现出过敏反应。尘螨种类繁多,其中屋尘螨和粉尘螨是与人类过敏反应相关的两种重要致敏物种。据当前文献报道显示,粉尘螨中已发现有15种过敏原,分别为Der f1,2,3,6,7,8,10,11,14,15,16,17,18,21,24,profilin作为主要过敏原在植物花粉及食物中已被报道,但国内外尚未有关于粉尘螨profilin作为过敏原的报道。本研究以粉尘螨profilin蛋白为研究对象,通过分子生物学技术和临床实验数据相结合的方法,首次证明粉尘螨profilin是粉尘螨内一种新过敏原。目的:(1)获得粉尘螨profilin全基因序列,构建表达载体,诱导表达获得大量重组蛋白并鉴定进行临床皮肤测试(SPT)。(2)通过粉尘螨profilin重组蛋白建立小鼠过敏性哮喘模型,评价其免疫原性。(3)通过临床过敏性患者血清特异性Ig E结合检测尘螨profilin与鱼尾葵花粉和芒果果实profilin的交叉反应性。(4)通过细胞因子诱导小鼠骨髓内单核细胞分化获得DC细胞,对粉尘螨profilin的致敏机理进行初步探索。方法:(1)根据合作单位香港中文大学提供的粉尘螨profilin全基因序列设计引物,提取粉尘螨总RNA,克隆得到粉尘螨profilin蛋白基因并连接至表达载体,IPTG诱导表达菌后,获得菌体产物进行Ni-NTA亲和层析纯化并获得的高纯度蛋白。通过Ig E-Western blotting(Ig E-WB)实验、Ig E-ELISA实验和人体皮肤点刺实验(SPTs)等试验对重组蛋白进行过敏原性鉴定;(2)18只BALB/c小鼠随机分成3组,A组为粉尘螨粗提液组(DME组),B组为粉尘螨profilin重组蛋白组(profilin组),C组PBS正常对照组(control组);A组用100μg尘螨粗浸液加4mg氢氧化铝致敏,B组注射100μg尘螨重组profilin加4mg氢氧化铝致敏,C组小鼠用磷酸盐缓冲液(PBS)取代过敏原进行皮下注射。第3、7天加强致敏,在第14天将所有小鼠麻醉后,A组和B组分别用50μg尘螨粗浸液和重组profilin滴鼻激发,C组用等量的PBS代替变应原,进行滴鼻激发,每天1次,连续7天。最后一次激发24h后,所有小鼠通过全体积扫描仪进行气道高反应性检测;取血,分离脾脏,进行支气管肺泡灌洗(BALF)并对总细胞数及炎性细胞数进行统计;通过HE染色病理切片观察肺部的炎症反应;MTS试剂盒检测脾细胞增殖水平;用ELISA法检测血清中抗原特异性抗体Ig E和Ig G1,及脾细胞培养上清中INF-γ和IL-4的分泌水平。(3)与粉尘螨profilin方法类似,克隆表达获得鱼尾葵花粉和芒果profilin重组蛋白。同时分别收集20份临床粉尘螨、15份鱼尾葵花粉及15份芒果过敏性患者血清作为一抗,通过ELISA实验判断尘螨profilin与鱼尾葵花粉及芒果过敏原profilin之间的交叉反应性。将诱导获得的小鼠原代树突状细胞(DCs)分为4组,即profilin刺激组、profilin+TLR4阻断抗体组和空白对照组。通过q-PCR及Western方法检测TIM4的表达量。结果:①克隆profilin样蛋白基因序列,成功构建p ET28a-profilin表达载体,在大肠杆菌宿主菌内高效表达,经纯化获得大量可溶性重组蛋白。临床皮试点刺实验结果显示,在14例粉尘螨过敏性患者中有3例呈现出对profilin的阳性反应。Western Blot和ELISA实验也表明粉尘螨profilin与3例阳性患者的血清内Ig E有较强的结合能力,而健康对照组血清均为阴性。②由粉尘螨profilin重组蛋白建立的小鼠过敏性哮喘模型检测结果如下:A组和B组小鼠较C组肺部发生明显的炎症反应;肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数显著高于C组(P﹤0.01);A组和B组血清中抗原特异性Ig E、Ig G1的分泌水平均明显高于C组,但两组之间无明显差异;脾细胞的增殖与细胞因子分泌水平变化:小鼠在受到粉尘螨粗提液及粉尘螨profilin重组蛋白刺激后增殖明显;B组小鼠脾细胞IL-4的分泌水平高于C组,而INF-γ的分泌水平低于C组。但二者与A组相比,均无显著性差异。③当粉尘螨过敏性患者血清作为一抗进行ELISA检测,鱼尾葵花粉profilin表现出60%的Ig E反应性,芒果profilin有45%的Ig E反应性。反之,以鱼尾葵花粉和芒果过敏性患者血清作为一抗时,尘螨profilin分别表现出20%和26.7%阳性反应。粉尘螨profilin在树突状细胞(DCs)表面受体TLR4介导下引起表面分子TIM4表达上调,进而引发机体Th2型过敏反应。结论:本研究通过基因工程技术克隆表达了粉尘螨过敏原profilin,经一系列鉴定表明它是粉尘螨过敏原组分中又一新发现过敏原。这为

关键词：粉尘螨profilin 过敏原性动物模型 TIM4 交叉反应性

新型冠状病毒灭活疫苗对Beta和Delta变异株的交叉中和活性

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中华微生物学和免疫学杂志 2022年第6期42卷 451-455页

作者：郑学学黄保英蒋聪利张现臣王国蒨陈玉娟李娜谭文杰刘建凯北京民海生物科技有限公司质量控制部北京102600 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委员会生物安全重点实验室北京102206 深圳康泰生物制品股份有限公司质量控制部深圳518057

目的评估新型冠状病毒灭活疫苗免疫人群和小鼠血清对变异株(Delta株和Beta株)的交叉中和活性。方法各取20份人群常规两剂基础免疫血清、三剂加强免疫血清和两剂小鼠免疫血清作为实验材料,采用新型冠状病毒原型株、Delta和Beta变异株3株... 详细信息

目的评估新型冠状病毒灭活疫苗免疫人群和小鼠血清对变异株(Delta株和Beta株)的交叉中和活性。方法各取20份人群常规两剂基础免疫血清、三剂加强免疫血清和两剂小鼠免疫血清作为实验材料,采用新型冠状病毒原型株、Delta和Beta变异株3株病毒,在生物安全三级实验室中采用微量中和试验检测中和抗体。通过分析不同稀释度血清对固定剂量病毒的中和活性,计算血清阳性率和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT),评估免疫血清的交叉中和水平。结果人免疫血清对不同变异株的阳性率均大于95%;基础免疫后,接种者血清对原型株、Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别为109、41和15,与原型株比较,针对Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别下降2.7倍和7.3倍;加强免疫后,接种者血清对原型株、Delta和Beta株的中和抗体GMT分别为446、190和86,与原型株比较,针对Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别下降2.3倍和5.2倍。小鼠免疫血清对不同变异株的阳性率均为100%;对原型株、Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别为2037、862和408,与原型株比较,针对Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别下降2.4倍和5.0倍。结论新型冠状病毒灭活疫苗免疫后的人群和小鼠血清均可对Delta和Beta变异株产生一定水平的中和保护,且人群加强免疫后可产生更高水平的中和抗体和交叉中和抗体,为该疫苗的临床应用和保护效果评估提供了重要参考。

关键词：新型冠状病毒灭活疫苗基础免疫加强免疫变异株交叉中和

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粉尘螨消化系统超微结构观察

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2013年第6期31卷 490-492页

作者：王月明刘晓宇蒋聪利黄礼年孙新刘志刚深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所深圳518060 蚌埠医学院第一附属医院呼吸科蚌埠233000 蚌埠医学院寄生虫学教研室蚌埠233000

粉尘螨50只经2.5%戊二醛前固定后,使用1%锇酸后固定,经乙醇梯度脱水、包埋、超薄切片、正染色后,透射电镜观察其超微结构。粉尘螨消化系统由前、中和后肠三部分构成,其中中肠进一步分为前中肠和后中肠。前肠和后肠内覆表皮,中肠内覆微... 详细信息

粉尘螨50只经2.5%戊二醛前固定后,使用1%锇酸后固定,经乙醇梯度脱水、包埋、超薄切片、正染色后,透射电镜观察其超微结构。粉尘螨消化系统由前、中和后肠三部分构成,其中中肠进一步分为前中肠和后中肠。前肠和后肠内覆表皮,中肠内覆微绒毛。此外,前中肠可见多种肠壁上皮细胞,细胞顶端微绒毛较短;后中肠微绒毛极长,肠腔可见围食膜包绕的食物团块,团块内含大量细菌。粉尘螨消化系统各肠道的细胞构成不同,尤其中肠肠壁上皮细胞的形态、种类多样,中肠为粉尘螨消化吸收的主要部位。

关键词：粉尘螨消化系统超微结构

新冠灭活疫苗不同免疫针次和免疫间隔诱导抗体免疫反应的比较

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中国生物制品学杂志 2022年第4期35卷 385-390,398页

作者：苍天乐李克雷蒋聪利胡威刘思远王海欣王美荣刘建凯刘建东北京民海生物科技有限公司结合疫苗新技术研究北京市重点实验室北京102600 深圳康泰生物制品有限公司广东深圳518000

目的比较新型冠状病毒灭活疫苗不同免疫程序免疫小鼠后诱导的抗体免疫反应,以期为后续新型冠状病毒灭活疫苗免疫策略的制定提供实验依据。方法将新型冠状病毒灭活疫苗按1μg/(只·次)的免疫剂量免疫BALB/c小鼠,免疫间隔14 d免疫3针,免... 详细信息

目的比较新型冠状病毒灭活疫苗不同免疫程序免疫小鼠后诱导的抗体免疫反应,以期为后续新型冠状病毒灭活疫苗免疫策略的制定提供实验依据。方法将新型冠状病毒灭活疫苗按1μg/(只·次)的免疫剂量免疫BALB/c小鼠,免疫间隔14 d免疫3针,免疫间隔28 d免疫2针,每次免疫后14 d采血,分离血清,检测针对原型株新型冠状病毒诱导产生的免疫反应。结果新型冠状病毒灭活疫苗免疫间隔14 d 2针免疫后,针对原型株新型冠状病毒诱导产生的中和抗体滴度极显著低于3针免疫后(P<0.0001);免疫间隔28 d 2针免疫后14 d诱导产生的中和抗体几何平均滴度显著高于免疫间隔14 d 2针免疫后14 d(P<0.05);灭活疫苗免疫血清诱导产生的针对原型株新型冠状病毒的中和抗体滴度显著高于Beta和Delta新型冠状病毒变异株(P均<0.05)。结论新型冠状病毒灭活疫苗3针免疫能极大程度提高诱导产生的保护性抗体免疫反应,免疫间隔28 d诱导产生的免疫反应优于免疫间隔14 d;灭活疫苗免疫血清也能中和变异株新型冠状病毒。

关键词：新型冠状病毒灭活疫苗免疫程序中和抗体

花生过敏及其主要致敏原Ara h1的研究进展

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中国食品卫生杂志 2013年第6期25卷 571-575页

作者：何伟逸冯玥蒋聪利曹际娟刘志刚黄海珍吴序栎深圳大学生命科学学院广东深圳518060 辽宁出入境检验检疫局辽宁大连116001 深圳大学医学院广东深圳518060

花生是一种具有致敏作用的重要食品,能够引起严重的过敏反应。花生的致敏性研究是食物安全研究领域的一个重要课题。本文主要论述了近年来花生致敏现状及花生主要致敏原Ara h1研究进展,包括花生致敏特点、脱敏方法等方面的内容。对降低... 详细信息

花生是一种具有致敏作用的重要食品,能够引起严重的过敏反应。花生的致敏性研究是食物安全研究领域的一个重要课题。本文主要论述了近年来花生致敏现状及花生主要致敏原Ara h1研究进展,包括花生致敏特点、脱敏方法等方面的内容。对降低花生引起的过敏反应风险具有一定意义,同时为对花生过敏者的临床脱敏治疗提供理论依据。

关键词：过敏反应花生致敏原脱敏 Arah1 致敏原蛋白食物致敏

粉尘螨重组过敏原Der f 11(副肌球蛋白)克隆表达、纯化及免疫学鉴定

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中国免疫学杂志 2014年第6期30卷 736-740页

作者：蒋聪利邬玉兰幸鹏杨平常刘志刚深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所深圳518060

目的:克隆粉尘螨过敏原Der f 11基因,表达、纯化该蛋白,并鉴定其免疫活性。方法:人工合成粉尘螨第11组过敏原Der f 11基因,将其连接至pET-32a表达载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,通过Ni+亲和层析纯化重组过敏原Der f... 详细信息

目的:克隆粉尘螨过敏原Der f 11基因,表达、纯化该蛋白,并鉴定其免疫活性。方法:人工合成粉尘螨第11组过敏原Der f 11基因,将其连接至pET-32a表达载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,通过Ni+亲和层析纯化重组过敏原Der f 11。以粉尘螨过敏患者血清作为一抗,经Western blot方法分析Der f 11的免疫学特性。结果:获得高纯度的重组Der f 11蛋白,SDS-PAGE结果显示表达产物pET-32a(+)-Der f 11分子质量约为118 ku。重组过敏原Der f 11检测15份尘螨过敏性患者血清中特异性IgE,阳性率为20%。结论:获得的Der f 11重组蛋白具有与天然蛋白相似的免疫学活性,为标准化抗原的临床特异性诊断和治疗及进一步的实验研究奠定基础。

关键词：粉尘螨重组Deft 11 表达 Western blot IgE

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microRNA在过敏性哮喘中的作用

中华临床免疫和变态反应杂志 2014年第4期8卷 312-316页

作者：蒋聪利刘志刚夏立新深圳大学过敏反应与免疫学研究所深圳518060 深圳大学生命科学学院深圳518060

microRNA(miRNA)是一种短单链小分子RNA,与蛋白质一起形成RNA诱导沉默复合体,引起靶mRNA的降解或抑制其翻译,所以miRNA的变化可影响机体大部分基因的表达。自从在哺乳动物细胞中被发现后,miRNA在过敏性疾病中的重要作用近些年来正逐步... 详细信息

microRNA(miRNA)是一种短单链小分子RNA,与蛋白质一起形成RNA诱导沉默复合体,引起靶mRNA的降解或抑制其翻译,所以miRNA的变化可影响机体大部分基因的表达。自从在哺乳动物细胞中被发现后,miRNA在过敏性疾病中的重要作用近些年来正逐步得到研究者重视。该文综述了miRNA在过敏性哮喘中的功能,主要包括miRNA的生成、调节辅助T细胞极化、在炎性反应和组织反应中的变化,胞外miRNA作为过敏性哮喘诊断的生物指标;并对miRNAs在未来的研究和应用进行展望。

关键词： microRNA 过敏性哮喘辅助T细胞生物指标

粉尘螨重组变应原Der f8的表达、纯化和免疫学鉴定

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南昌大学学报（医学版） 2014年第2期54卷 5-9页

作者：蒋聪利邬玉兰李维中肖小军杨平常刘志刚深圳大学生命科学学院深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所广东深圳518060

目的获得大量粉尘螨重组变应原Der f8蛋白,检测其免疫原性。方法合成粉尘螨第8组变应原(Der f8)基因,将其连接至pET-32a载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组Der f8蛋白,圆二色谱初步检测该蛋白二级结构,以粉尘螨过敏患... 详细信息

目的获得大量粉尘螨重组变应原Der f8蛋白,检测其免疫原性。方法合成粉尘螨第8组变应原(Der f8)基因,将其连接至pET-32a载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组Der f8蛋白,圆二色谱初步检测该蛋白二级结构,以粉尘螨过敏患者血清作为一抗,经免疫印迹法(Western-blotting)方法分析Der f8的免疫学特性。结果重组工程菌经IPTG诱导后,高效表达出Der f8蛋白,为可溶性蛋白。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量约为45ku。Der f8重组蛋白二级结构中,α螺旋34.5%,β折叠12.6%,无规则卷曲53.9%。表达产物经亲和层析纯化后,Western Blot印迹有明显条带显示。结论纯化后的Der f8具有较高的纯度和较强的免疫学活性,为粉尘螨过敏反应性疾病的特异性诊断和治疗及进一步的实验研究奠定了基础。

关键词：粉尘螨重组Der f8 表达 Western-blotting方法

11Cr-5.5Co-2.5W马氏体耐热钢蠕变性能与长时持久强度预测

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钢铁 2024年

作者：董贞蒋聪聪陈雷向志东武汉科技大学材料学部武汉科技大学省部共建耐火材料与冶金国家重点实验室

耐热钢在高温环境下的长时蠕变持久强度评估和微观组织稳定性研究一直是业界关注的焦点。为此，以一种未添加氮的11Cr-5.5Co-2.5W（质量分数，%）马氏体耐热钢为研究对象，开展了650、675、700、725 ℃不同应力条件下的短时蠕变断裂试... 详细信息

耐热钢在高温环境下的长时蠕变持久强度评估和微观组织稳定性研究一直是业界关注的焦点。为此，以一种未添加氮的11Cr-5.5Co-2.5W（质量分数，%）马氏体耐热钢为研究对象，开展了650、675、700、725 ℃不同应力条件下的短时蠕变断裂试验，通过OM、SEM、EDS、XRD、TEM等多种表征技术，对试验钢微观组织和析出相进行分析；基于新蠕变模型结合Monkman-Grant关系式，对该耐热钢在600、650 ℃下服役105h的持久强度进行评估，并将预测结果与同条件下的P92钢进行了比较。结果显示，该耐热钢经过正火（1 100 ℃保温1 h）和回火热处理（780 ℃保温1 h）后，得到了全马氏体组织，析出相主要为M23C6、MX相，在蠕变试验后钢中还观察到了Laves相，未发现Z相等其他相生成。基于短时蠕变试验结果（断裂时间短于5000 h），通过新蠕变模型结合Monkman-Grant关系式预测得到，该钢在600、650 ℃下服役105h的持久强度依次为108、52 MPa；蠕变试样微观组织和析出相定量分析结果显示：在测试应力比σ/σTS（应力/拉伸强度）区间（0.229～0.493）内，马氏体板条和边界处析出相尺寸的粗化速率随应力比项的降低无明显变化，表明利用新蠕变模型研究马氏体耐热钢的蠕变行为与微观结构演变之间的关系是可行的。此外，与P92钢相比，虽然在相同条件下该耐热钢展示了更高的高温抗拉强度，但其105h蠕变持久强度的预测结果略低，这一差异主要与钢在两个过程中的强化机制和微观结构演变不同相关。

关键词： 9%～12%Cr马氏体耐热钢蠕变模型组织演变持久强度蠕变寿命预测