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植物甜蛋白基因Thaumatin表达载体的构建及对雪莲果的遗传转化

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植物甜蛋白基因Thaumatin表达载体的构建及对雪莲果的遗传转化

作者：蒋素华河南农业大学

学位级别：硕士

甜蛋白(Thaumatin)存在于西非热带雨林中一种竹芋科多年生草本(Thaumatococcus daniellii Benth)的果实胶质假种皮中。Thaumatin蛋白有甜味,而且它还具有低热量、安全无毒、甜味纯正及可被降解为体内所需氨基酸等优点,是一类高甜度而又... 详细信息

甜蛋白(Thaumatin)存在于西非热带雨林中一种竹芋科多年生草本(Thaumatococcus daniellii Benth)的果实胶质假种皮中。Thaumatin蛋白有甜味,而且它还具有低热量、安全无毒、甜味纯正及可被降解为体内所需氨基酸等优点,是一类高甜度而又不含糖的新型甜味剂,所以它被认为有希望发展成为食品工业中营养性碳水化合物的替代品而成为未来新型的甜味剂。但是T. daniellii在原产地之外不能正常结实,并且引种不成功难以大量生产,致使甜味蛋白成为十分昂贵的商品。生物技术的迅速发展启发人们用基因重组的手段开发甜蛋白,对这些甜味蛋白和矫味蛋白进行了克隆和测序,并将其表达于其他宿主。已经实现了甜蛋白在微生物中的表达,个别的还在一些植物中得到表达。因此,本试验在吸取前人经验的基础上,构建了植物表达载体pBI121- Thaumatin,并将其转入根癌农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌的介导将Thaumatin基因导入雪莲果中,并对转基因植株进行了检测,借以初步探讨甜蛋白在植物中的转化和表达情况,为进一步转化园艺植物打下了基础。实验结果如下:(1)甜蛋白Thaumatin基因的人工合成和克隆本实验根据已报道的Thaumatin基因序列,采用重叠延伸PCR法人工合成Thaumatin全长基因,与T载体pMD19-T连接后转化DH5α,通过菌落PCR、双酶切、测序鉴定,得到克隆载体pMD-Thaumatin。(2)甜蛋白Thaumatin基因植物表达质粒pBI121- Thaumatin的构建与鉴定。利用DNA重组技术,将植物甜蛋白Thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,通过PCR、酶切、电泳鉴定Thaumatin基因已成功构建到植物表达质粒pBI121中。(3)pBI121- Thaumatin质粒转化根癌农杆菌重组质粒pBI121- Thaumatin通过直接转化法导入农杆菌EHA105中,利福平(Rif)和卡那霉素(Kan)平板筛选阳性克隆,有单菌落生长,经过菌液PCR鉴定,证明重组质粒已转进农杆菌EHA105中。(4)植株再生体系的建立采用无菌苗雪莲果(Smallanthus sonchifolius)叶片为外植体,以MS为基本培养基,筛选出MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L形成愈伤组织, MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L以诱导不定芽的分化,并于1/2MS+NAA0.2mg/L生根培养,获得完整再生植株。(5)转化体筛选及植株再生将预培养3-4天的外植体与农杆菌菌液浸染5-15分钟后,共培养2-3天,然后转化到含MLPN和Kan的选择培养基上进行分化筛选,转入外源基因的转化体将会在这一系列筛选过程中发芽、生根,获得转基因植株。(6)转基因植株PCR检测提取转基因植株基因组DNA后,PCR扩增Thaumatin基因,证明thaumatin基因已导入雪莲果中,转化率为36.4%。

关键词： Thaumatin基因表达载体的构建雪莲果再生体系的建立遗传转化

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教师慢性咽喉炎的防治

中国学校卫生 1991年第1期 25-27页

作者：蒋素华淮北煤炭师范学院医院安徽淮北市 235000

教师咽喉炎症,是教师职业的常见病,多见于中、老年教师。职业发音过度,声嘶力竭,引起声带小结,妨碍声带闭合。加之长期受粉尘、物理、化学气体的刺激,或是嗜好烟酒,曾有急性喉炎多发病史,使邻近组织慢性炎症漫延,而形成慢性咽炎。

关键词：慢性咽喉炎气郁不达虚火上炎肺气虚肺气不足肺病辨证

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汉英双语者汉语口语中的英语化特征研究

外语教学与研究 2006年第6期38卷 411-417页

作者：吴一安蒋素华北京外国语大学中国外语教育研究中心 100089 深圳大学文学院英语系 518060

本文旨在通过实证调查探究汉英双语者汉语口语中的英语化特征。研究表明,第一,被访谈者话语中出现大量汉英语码转换。第二,他们口语中的英语化特征主要表现为(1)更多地在主语位置上使用代词和更多使用“主语+是+形容词+的”结构,致使汉... 详细信息

本文旨在通过实证调查探究汉英双语者汉语口语中的英语化特征。研究表明,第一,被访谈者话语中出现大量汉英语码转换。第二,他们口语中的英语化特征主要表现为(1)更多地在主语位置上使用代词和更多使用“主语+是+形容词+的”结构,致使汉语口语中的SVO结构增多;(2)中心名词前使用长修饰语;(3)更多地使用类似于英语中不定冠词的“‘一’+量词”结构。第三,不平衡双语者和平衡双语者的汉语口语有明显不同。文章最后从社会、心理、语言角度探讨了被访谈者的话语行为。

关键词：汉英双语者英语化特征语言接触

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蕙兰MADS基因APETALA1/FRUITFULL-like的克隆和时空表达特性(英文)

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生物工程学报 2013年第2期29卷 203-213页

作者：田云芳袁秀云蒋素华崔波苏金乐河南农业大学林学院河南郑州450002 郑州师范学院生物研究所河南郑州450044

为研究兰花成花转变及花发育的调控机理,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,从蕙兰萼片中克隆出一个APETALA1/FRUITFULL-like(AP1/FUL-like)基因,命名为CfAP11,GenBank登录号为JQ031272.1。该基因编码的氨基酸序列与MADS-box蛋白家族中类AP1/FUL亚家族中球花石斛FRUITFULL-like具有较高的同源性(84%),系统进化分析表明该蛋白的氨基酸序列与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。生物信息学分析推测表明,该基因编码的蛋白具有MADS保守域和相对保守的K区,二级结构中-螺旋所占比例较高(58.97%),三级结构与月季、水稻和水仙非常相似。相对荧光定量PCR分析结果表明:CfAP11在根中表达痕量,生殖期比营养期叶片中表达量低、盛花期比花蕾期花葶中表达量高,由此推测,CfAP11可能与蕙兰的成花诱导、花发育有关;并发现CfAP11在盛花期花葶和子房中表达量远高于其他组织,表明其可能以某种机制参与果实的形成过程。

关键词：蕙兰 AP1/FUL-like RACE 时空表达

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牡丹组织培养

安徽农业科学 2009年第33期37卷 16253-16254,16260页

作者：纪庆亮蒋素华秦仪利南京林业大学森林资源与环境学院江苏南京210037 河南农业大学生命科学院河南郑州450002 河南省鹤壁市培红高中河南鹤壁458030

[目的]研究牡丹离体培养技术,解决牡丹快速繁殖问题。[方法]以MS为基本培养基,添加不同浓度的NAA、BA及IAA,对牡丹的胚进行体外培养。[结果]在没有添加任何激素的培养基上,离体胚生长类似种子萌发时胚的生长模式,子叶扩大伸长,达到约种... 详细信息

[目的]研究牡丹离体培养技术,解决牡丹快速繁殖问题。[方法]以MS为基本培养基,添加不同浓度的NAA、BA及IAA,对牡丹的胚进行体外培养。[结果]在没有添加任何激素的培养基上,离体胚生长类似种子萌发时胚的生长模式,子叶扩大伸长,达到约种子大小时停顿,根伸长生长极其显著;BA促进子叶膨大生长,当BA浓度增大时根生长受到抑制;NAA促进愈伤组织形成,抑制根生长。0.1mg/LBA促进牡丹胚的胚轴、根生长,有利于幼苗形成。[结论]为牡丹扩大繁殖提供了可行性途径。

关键词：牡丹培养基胚培养

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