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作者：蒋孝燕江南大学

学位级别：硕士

β-半乳糖苷酶(EC 3.***.1.23)俗称乳糖酶,不仅能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖,而且具有转糖基活性,是一种重要的糖苷水解酶,在食品、医药和分析化学等领域都有重要应用。近年来随着糖生物学的发展,转糖基β-半乳糖苷酶逐渐成为糖类合成的... 详细信息

β-半乳糖苷酶(EC 3.***.1.23)俗称乳糖酶,不仅能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖,而且具有转糖基活性,是一种重要的糖苷水解酶,在食品、医药和分析化学等领域都有重要应用。近年来随着糖生物学的发展,转糖基β-半乳糖苷酶逐渐成为糖类合成的重要工具酶,被用于合成各种糖基化合物,乳果糖、低聚半乳糖就是其中比较突出的两种。本课题旨在从自然界筛选得到一株水解活力较高、兼具转糖基活性、生长发育良好的β-半乳糖苷酶产生菌株,对其进行菌种鉴定,紧接着从基因克隆、基因表达、重组菌诱导表达条件优化、重组酶酶学性质研究以及酶法合成低聚糖等方面进行系统研究,进而为其在功能性低聚糖生产领域的应用打下一定基础。通过四级筛选,从自然界中得到一株水解活力相对较高、兼具转糖基活性、生长发育良好的β-半乳糖苷酶产生菌株,借助菌落形态观察、生化指标测定以及16S rDNA序列分析,鉴定其为Klebsiella pneumoniae 285。通过单因子试验和正交试验对Klebsiella pneumoniae 285产酶条件进行优化,得到最佳培养基组成为乳糖50g/L,蛋白胨20g/L,酵母浸膏10g/L,氯化钠3g/L;最优发酵条件为种龄6h,起始pH7.0,接种量3%,装液量40mL/250mL,30℃下发酵8h。最优条件下产酶活力为7.21U/mL。以乳糖为底物Klebsiella pneumoniae 285β-半乳糖苷酶催化生成低聚糖,反应液组分包括果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、低聚糖(包括转移二糖、低聚三糖)。反应液总糖中,葡萄糖占9.7%,乳糖占26.9%,低聚糖占53.7%。以乳糖、果糖为底物时,反应液总糖中,果糖占21.4%,葡萄糖占5.1%,乳糖占23.4%,低聚糖占45.0%。 PCR扩增Klebsiella pneumoniae 285β-半乳糖苷酶编码基因,构建DH5α/pMD18-T-bgaB以及DH5α/pMD18-T-LacZ两株克隆菌株,委托测序,结果表明两段序列与已报道的不同亚种对应序列的同源性均极高。成功构建BL21/pET-28a(+)-bgaB以及BL21/pET-28a(+)-LacZ两株表达菌株,同时实现酶活表达。通过单因素试验对两株重组菌的诱导表达条件进行优化,结果得到BL21/pET-28a(+)-bgaB重组菌的最佳诱导条件为诱导时机135min、IPTG浓度0.2mmol/L、诱导长度8h;BL21/pET-28a(+)-LacZ重组菌的最佳诱导条件为诱导时机120min、IPTG浓度0.6mmol/L、诱导长度9h。用金属镍螯合琼脂糖凝胶层析柱分离纯化带(His)6标签的重组酶,得到两种重组酶的最适咪唑洗脱浓度均为350mmol/L,电泳检测均获得单一条带。纯化后bgaB重组β-半乳糖苷酶的比酶活为185.45U/mg,是纯化前比酶活的92.46倍;纯化后LacZ重组β-半乳糖苷酶的比酶活为62.05U/mg,是纯化前比酶活的9.09倍。酶学性质研究表明,bgaB重组β-半乳糖苷酶的最适作用温度为50℃,40℃、50℃下均呈现良好的稳定性;最适作用pH为8.0,在pH7.5-9.0范围内呈现良好的稳定性;金属离子Cu2+和螯合剂EDTA二钠对酶活有明显的抑制作用,其它离子对酶活影响不大甚至呈现一定的激活作用。LacZ重组β-半乳糖苷酶的最适作用温度为40℃,40℃、50℃下均呈现良好的稳定性;最适作用pH为7.5,在pH7.5-9.0范围内呈现良好的稳定性;金属离子Pb2+、Cu2+和螯合剂EDTA二钠对酶活有一定的抑制作用,其它离子对酶活影响不大甚至呈现相当的激活作用。动力学参数测定表明,bgaB重组β-半乳糖苷酶的Vmax为227.27μmol/(mg protein·min),Km为0.82mmol/L;LacZ重组β-半乳糖苷酶的Vmax为58.82μmol/(mg protein·min),Km为0.72mmol/L。以乳糖为底物重组β-半乳糖苷酶催化生成低聚糖,选用bgaB重组β-半乳糖苷酶时,反应液总糖中,葡萄糖占6.3%,乳糖占45.2%,低聚糖占42.3%;选用LacZ重组β-半乳糖苷酶时,葡萄糖占12.8%,乳糖占14.1%,低聚糖占60.4%。以乳糖、果糖为底物重组β-半乳糖苷酶催化生成低聚糖,选用bgaB重组β-半乳糖苷酶时,反应液总糖中,果糖占21.2%,葡萄糖占2.8%,乳糖占28.3%,低聚糖占44.9%;选用LacZ重组β-半乳糖苷酶时,果糖占21.5%,葡萄糖占11.7%,乳糖占8.9%,低聚糖占46.4%。

关键词： β-半乳糖苷酶筛选鉴定克隆表达酶学性质低聚糖

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传统豆渣菌的菌相分析及蛋白酶和纤维素酶主要产生菌株的鉴定

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食品工业科技 2012年第1期33卷 171-174页

作者：张燕鹏杨瑞金王贺蒋孝燕江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学食品学院江苏无锡214122

对江西瑞金的特色发酵食品-豆渣菌进行了菌相分析,结果表明豆渣菌是以真菌和细菌为主的混合型发酵食品。真菌主要为串珠霉属(Monilia)、根霉属(Rhizopus)和酵母属(Saccharomyces);细菌主要为微球菌属(Micrococcus)葡萄球菌属(Staphyloco... 详细信息

对江西瑞金的特色发酵食品-豆渣菌进行了菌相分析,结果表明豆渣菌是以真菌和细菌为主的混合型发酵食品。真菌主要为串珠霉属(Monilia)、根霉属(Rhizopus)和酵母属(Saccharomyces);细菌主要为微球菌属(Micrococcus)葡萄球菌属(Staphylococcus)、片球菌属(Pediococcus)、异常球菌属(Deinococcus)、肠杆菌属(Enterobacterspp),非乳杆菌属和三株枯草芽孢杆菌(***)。串珠霉属真菌具有纤维素酶和蛋白酶活力,枯草芽孢杆菌和根霉属真菌则具有蛋白酶活力。

关键词：豆渣菌菌相分析纤维素酶蛋白酶

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转半乳糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选鉴定、产酶条件优化及酶法制备乳果糖

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食品与发酵工业 2010年第8期36卷 17-21页

作者：蒋孝燕杨瑞金王贺叶发银张燕鹏华霄江南大学食品科学与技术国家重点实验室硕士研究生江苏无锡214122 江南大学食品学院江苏无锡214122

借助形态观察、生理生化指标测定及16S rNDA序列分析,对从土壤中筛选得到的转半糖基β-半乳糖苷酶产生菌进行鉴定,确定其为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)285。通过单因子试验和正交试验,对该菌株产转半乳糖基β-半乳糖苷酶的... 详细信息

借助形态观察、生理生化指标测定及16S rNDA序列分析,对从土壤中筛选得到的转半糖基β-半乳糖苷酶产生菌进行鉴定,确定其为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)285。通过单因子试验和正交试验,对该菌株产转半乳糖基β-半乳糖苷酶的培养条件进行优化。优化的发酵条件为:种龄6 h,起始pH值7.0,接种量3%,装液量40 mL/250 mL,30℃下发酵8 h。该培养条件下产酶量达7.21 U/mL。以0.1 mol/L、pH值7.0 K3PO4缓冲溶液配制的40%乳糖、20%果糖(w/v)溶液为底物,调整酶活力至3.5 U/mL,50℃恒温水浴反应6 h,HPLC分析转半乳糖基产物,得乳果糖产量为20.8 g/L,即3.47 g/(L.h)。

关键词：肺炎克雷伯氏菌 β-半乳糖苷酶乳果糖

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基于鱼类生物完整性指数的曹娥江流域水生态系统健康评价

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生态与农村环境学报 2023年第6期39卷 767-773页

作者：蒋孝燕陈超冯志政金叶飞杨庆满任岗绍兴文理学院生命与环境科学学院浙江绍兴312000 宁波市江南中学浙江宁波315800 绍兴市水产技术推广中心浙江绍兴312000 浙江绍兴鉴湖国家湿地公园管理委员会浙江绍兴312036

2016—2018年对曹娥江干流以及主要支流的9个采样点进行鱼类调查,构建曹娥江鱼类生物完整性指数(F-IBI)体系,评价曹娥江流域水生态系统的健康状况。共采集到鱼类标本17116尾,分属12目25科69属107种。从种类组成与丰度、营养结构、环境... 详细信息

2016—2018年对曹娥江干流以及主要支流的9个采样点进行鱼类调查,构建曹娥江鱼类生物完整性指数(F-IBI)体系,评价曹娥江流域水生态系统的健康状况。共采集到鱼类标本17116尾,分属12目25科69属107种。从种类组成与丰度、营养结构、环境耐受性、繁殖共位群、鱼类数量与健康状况5个属性的23个候选指标中筛选出鲤形目鱼类种类数(M3)、中下层鱼类物种数占比(M9)、敏感性鱼类个体数占比(M15)、借助贝类产卵鱼类物种数占比(M19)4个指标作为计算曹娥江流域F-IBI的核心指标,建立具有诊断意义的鱼类生物完整性评分标准,并对曹娥江流域9个采样点的鱼类生物完整性状况进行了评价。结果表明,曹娥江流域不同采样点中干流的健康状况等级为“极差~差”到“一般”,支流为“一般”到“好”。水质污染、水利设施阻挡和过度捕捞是造成曹娥江干流水生态系统健康水平较低的重要因素,而水利设施则可能是造成支流长诏健康水平较低的重要因素。

关键词：曹娥江鱼类生物完整性指数河流健康评价

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密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆及其表达条件的优化

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食品科学 2010年第15期31卷 171-176页

作者：王贺杨瑞金华霄钱婷婷张文斌蒋孝燕江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学食品学院江苏无锡214122

为克隆、表达密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶(GI)基因xylA,并对其诱导表达条件进行初步优化。采用Slowdown PCR方法克隆得到密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)CICIM B0118(A)的葡萄糖异构酶基因xylA,构建pET-28a(+)-xylA表... 详细信息

为克隆、表达密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶(GI)基因xylA,并对其诱导表达条件进行初步优化。采用Slowdown PCR方法克隆得到密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)CICIM B0118(A)的葡萄糖异构酶基因xylA,构建pET-28a(+)-xylA表达载体,并转化至***21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对其表达产物进行SDS-PAGE电泳。结果表明,融合蛋白分子质量约为45kD。在诱导时间9h、0.6mmol/LIPTG、30℃和OD600nm值为0.8的最适培养条件下,酶比活力最高达到62.42U/mL。

关键词：密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶表达 Slowdown PCR

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一种连续分离纯化酪蛋白磷酸肽的新工艺

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食品科学 2011年第8期32卷 24-28页

作者：徐桂敏杨瑞金张文斌赵伟华霄蒋孝燕江南大学食品科学与工程国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学食品学院江苏无锡214122

为建立一条制备酪蛋白磷酸肽(CPPs)的新工艺路线。采用酶解与超滤耦联技术初步分离制备酪蛋白生物活性肽,然后通过树脂层析将酪蛋白生物活性肽中的酪蛋白磷酸肽和非磷酸肽分离。选用碱性蛋白酶Alcalase在切向流酶膜反应器中(膜截留分子... 详细信息

为建立一条制备酪蛋白磷酸肽(CPPs)的新工艺路线。采用酶解与超滤耦联技术初步分离制备酪蛋白生物活性肽,然后通过树脂层析将酪蛋白生物活性肽中的酪蛋白磷酸肽和非磷酸肽分离。选用碱性蛋白酶Alcalase在切向流酶膜反应器中(膜截留分子质量10kD)连续酶解3h、酶解温度50℃、pH8.5。重点研究大孔弱碱性阴离子交换树脂D303对酪蛋白生物活性肽的分离纯化工艺,并采用单因素试验优化CPPs的分离纯化工艺参数,确定D303树脂的较佳动态吸附解吸条件:上样流速1BV/h、上样量100mL、洗脱温度45℃、洗脱酸浓度0.15mol/L HCl,获得磷酸肽N/P比为7.21,P洗脱得率为93.11%。

关键词：酶膜反应器层析分离酪蛋白磷酸肽 N/P 纯化

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基因工程菌EGs2产β-葡聚糖酶条件优化及产酶特性

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农业生物技术学报 2007年第4期15卷 708-712页

作者：李青青陈启和蒋孝燕张秀艳李婷何国庆浙江大学食品科学与营养系华中农业大学食品安全与微生物学系

用乳清粉作为主要培养基组成,采用正交试验对大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌EGs2的发酵条件进行了优化,并对粗酶液的酶学性质进行了研究。重组菌EGs2的最佳发酵条件为:床转速170r/min,接种量1%,发酵培养基初始pH 6.0,种龄12h。重组菌... 详细信息

用乳清粉作为主要培养基组成,采用正交试验对大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌EGs2的发酵条件进行了优化,并对粗酶液的酶学性质进行了研究。重组菌EGs2的最佳发酵条件为:床转速170r/min,接种量1%,发酵培养基初始pH 6.0,种龄12h。重组菌EGs2 β-葡聚糖酶的表达与菌体生长呈正相关,发酵14h后,菌体生物量最高可达1.71g/L,β-葡聚糖酶活力最高可达321.56U/mL。所得粗酶液的最适反应温度60℃,pH 6.0,在70℃以下保温20min后,残余酶活力均在80%以上。在pH 5.0～9.0放置48h后仍能保持均90%以上的残余酶活力。

关键词： β-葡聚糖酶重组菌EGs2 发酵条件酶学性质

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社会主义文化强国建设的动力结构与机制——一个改革动力论的分析

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开放时代 2025年第1期 13-25+5页

作者：田嵩燕中共中央党校文史教研部

社会主义文化强国建设是由多种动力源共同推动的。其中，精神动力来自历史自信和文化自信，组织动力来自繁荣发展社会主义先进文化的制度及其治理效能，发展动力来自人民精神文化需求。中国共产党的领导作为联结和控制整个动力系统的中... 详细信息

社会主义文化强国建设是由多种动力源共同推动的。其中，精神动力来自历史自信和文化自信，组织动力来自繁荣发展社会主义先进文化的制度及其治理效能，发展动力来自人民精神文化需求。中国共产党的领导作为联结和控制整个动力系统的中轴，以文化体制机制改革为杠杆推动系统运转，使得各动力源联动配合，共同作用，形成合力，为社会主义文化强国建设提供了强劲持续的动力支持。

关键词：社会主义文化强国文化体制机制改革动力结构动力机制改革动力

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社区学习场景：概念溯源、内涵特征与实践样态

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成人教育 2025年第1期 19-27页

作者：吴思孝浙江开放大学

场景是在一定时空背景下由多个要素参与的事件呈现，它是社会互动和技术赋能相结合的实践选择。从教育学视角关切社区生活，场景理论可作为社区居民投射终身学习需求的窗口。场景概念在历经表演情景、媒介情境、技术场景和文化消费场景... 详细信息

场景是在一定时空背景下由多个要素参与的事件呈现，它是社会互动和技术赋能相结合的实践选择。从教育学视角关切社区生活，场景理论可作为社区居民投射终身学习需求的窗口。场景概念在历经表演情景、媒介情境、技术场景和文化消费场景的过程中，内涵多变且具有显著的体验特点和时代特征。社区学习场景是场景理论在教育领域的具体体现。从学习者中心的角度看，普适的实践原则规范了社区丰富的学习行为，应从不同的认知视角解构社区学习的多元参与主体，以不同的发展模式践行社区学习的实践样态。根据自由度和参与度的不同，社区学习场景可在相应的象限内构成立体多维的课堂场景、路口场景、座椅场景、广场场景和星空场景等应用子场景，并依次形成形式多样的社区非正式学习实践样态。

关键词：场景理论社区学习场景终身学习理论框架

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当代青年自嘲镜像及其辩证省思

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中国青年研究 2025年

作者：宋德孝白靖楠苏州大学中国特色城镇化研究中心苏州大学马克思主义学院

近年来，青年群体中掀起一种自嘲现象。一些青年通过自我贬损的表达方式，以戏谑调侃的风格，呈现出一种不以为然、潇洒超脱的性格镜像，并将其作为参与社会交往、建构群体身份、表达精神状态的一种符号化工具。辩证来看，适度的自嘲行... 详细信息

近年来，青年群体中掀起一种自嘲现象。一些青年通过自我贬损的表达方式，以戏谑调侃的风格，呈现出一种不以为然、潇洒超脱的性格镜像，并将其作为参与社会交往、建构群体身份、表达精神状态的一种符号化工具。辩证来看，适度的自嘲行为并无实质性的破坏力量，它是青年融入社会的一种群体智慧，也反映了青年面对问题时乐观洒脱的一面；但过度的负面情绪释放，会导致青年精神内耗和价值迷失，要引起重视。因此，要动态研判青年的思想和行为倾向、纾解其成长和发展压力、关切其价值和情感需求，由此实现“自嘲文化”的价值归序。

关键词：青年自嘲自嘲话语青年亚文化

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