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糖丁基梭菌产丁醇途径在大肠杆菌中的构建及发酵

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微生物学报 2015年第11期55卷 1427-1436页

作者：李金韩瑞枝许国超董晋军倪晔江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

【目的】通过克隆来源于糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum DSM13864)丁醇合成途径的关键酶基因(thl A,bcs-operon和adh E),构建产丁醇大肠杆菌。【方法】以Clostridium saccharobutylicum DSM13864的基因组为模板,分别扩增丁醇途径关键酶基因thl A,bcs-operon(crt-bcd1-etf B2-fix B2-hbd)和adh E,构建了两个重组质粒p ETDuet-bcs和pRSFDuet-thl A-adh E,并成功转入*** JM109(DE3)实现异源表达,使大肠杆菌具备产丁醇能力。在半厌氧条件下进行重组菌的发酵,并研究不同培养基对产丁醇的影响。【结果】该重组菌在半厌氧条件下经摇瓶发酵丁醇产量达到25.4 mg/L,通过优化培养基后,在TB发酵培养基中丁醇产量可达到34.1 mg/L。【结论】通过构建重组共表达质粒,将糖丁基梭菌来源的丁醇途径关键酶基因在大肠杆菌中表达,成功构建产丁醇大肠杆菌。该研究提供了一株易于操作的丁醇发酵重组大肠杆菌,避免了传统梭菌发酵丁醇生产中苛刻的厌氧条件、易产孢子等限制问题。

关键词：糖丁基梭菌大肠杆菌丁醇半厌氧发酵

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太原市文物行政执法现状和问题剖析

文物鉴定与鉴赏 2019年第22期 68-70页

作者：董晋军太原市文物稽查队

新中国成立以来,国家重视文物资源的保护和开发,出台一系列法律法规保护文物资源。而文物行政执法是保护工作的重要保障,也是文物工作中的难点。文章结合太原市文物行政执法的现状,剖析了在执法过程中遇到的各种问题,并以此提出相应的... 详细信息

新中国成立以来,国家重视文物资源的保护和开发,出台一系列法律法规保护文物资源。而文物行政执法是保护工作的重要保障,也是文物工作中的难点。文章结合太原市文物行政执法的现状,剖析了在执法过程中遇到的各种问题,并以此提出相应的对策建议,以期对文物保护工作提供有价值的参考。

关键词：文物行政执法现状问题太原市

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可得然胶生产菌种的筛选及发酵条件优化

食品与生物技术学报 2018年第7期37卷 732-738页

作者：王萧玉竹董晋军许国超韩瑞枝倪晔江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

采用苯胺蓝平板筛选法从土壤中筛选并鉴定了一株产可得然胶的根瘤菌,并对该菌株发酵合成可得然胶的培养基进行优化。在单因素优化的基础上,设计4因素3水平的正交优化方案,优化结果显示,该菌株发酵产可得然胶的最优培养基组成为:葡萄糖50... 详细信息

采用苯胺蓝平板筛选法从土壤中筛选并鉴定了一株产可得然胶的根瘤菌,并对该菌株发酵合成可得然胶的培养基进行优化。在单因素优化的基础上,设计4因素3水平的正交优化方案,优化结果显示,该菌株发酵产可得然胶的最优培养基组成为:葡萄糖50 g/L,(NH4)2HPO42g/L,KH2PO41.5 g/L,Mg SO41.25 g/L,Fe SO4·7H2O 0.05 g/L,Mn SO40.02 g/L,Co Cl2·6H2O 0.01 g/L,Zn Cl20.01 g/L。经摇瓶发酵验证,可得然胶的产量和糖转化率较优化前分别提高了29.2%和5.4%,为进一步利用该根瘤菌发酵合成可得然胶奠定了良好基础。

关键词：可得然胶正交试验根瘤菌属苯胺蓝

全局转录机制工程法筛选丁醇耐受大肠杆菌及性质

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食品与生物技术学报 2019年第3期38卷 76-82页

作者：司海明韩瑞枝许国超董晋军倪晔江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

作者旨在采用一种快速有效的方法(全局转录机制工程方法)筛选一株具有较高丁醇耐受性的大肠杆菌。通过对全局转录因子σ^(70)进行随机突变,构建rpoD(编码σ^(70)因子)突变库。并采用高通量筛选的方法筛选获得丁醇耐受突变株E. coli JM10... 详细信息

作者旨在采用一种快速有效的方法(全局转录机制工程方法)筛选一株具有较高丁醇耐受性的大肠杆菌。通过对全局转录因子σ^(70)进行随机突变,构建rpoD(编码σ^(70)因子)突变库。并采用高通量筛选的方法筛选获得丁醇耐受突变株E. coli JM109/pHACM^(B8),并对该突变株的性质进行了研究。结果表明:丁醇耐受突变株B8能够耐受体积分数2%丁醇,且对其他有机溶剂也具有较高的耐受性,如体积分数3%异丁醇、体积分数8%乙醇、体积分数4%环己烷和体积分数0.3%甲苯。为进一步阐明了B8菌株丁醇耐受机制,分别对B8菌株和对照菌株E. coli JM109/p HACM^(WT)的生理特性进行了研究。结果显示突变株B8胞内的丁醇含量较对照菌株低55%;且在酸性环境下比对照菌株生长更好;此外Mg^(2+)有助于提高菌株B8的丁醇耐受性。本研究为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。

关键词：大肠杆菌丁醇有机溶剂耐受性全球转录机制工程

Clostridium saccharobutylicum DSM 13864细胞表面理化特性及固定化细胞产丁醇的性能

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化工进展 2015年第12期34卷 4214-4219页

作者：陈强董晋军许国超韩瑞枝倪晔江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院江苏无锡214122

糖丁基梭菌Clostridium saccharobutylicum DSM 13864能利用多种糖类为底物发酵产丁醇。本文研究了该菌体细胞表面的理化特性,并以砖块作为细胞固定化材料进行丁醇发酵。采用细菌吸附有机溶剂（MATS）法证明糖丁基梭菌细胞表面有强烈的... 详细信息

糖丁基梭菌Clostridium saccharobutylicum DSM 13864能利用多种糖类为底物发酵产丁醇。本文研究了该菌体细胞表面的理化特性,并以砖块作为细胞固定化材料进行丁醇发酵。采用细菌吸附有机溶剂（MATS）法证明糖丁基梭菌细胞表面有强烈的亲水性,并且等电点在p H值为3左右,这些特性有利于菌体与表面亲水多孔的砖块吸附。在60g/L葡萄糖发酵培养基中,以5~8目砖块作为固定化材料,流速为1.1L/min,发酵48h后,丁醇的浓度、得率和生产率分别达到11.02g/L、0.18g/g和0.23g/（L？h）,相比悬浮细胞发酵分别提高了10.53%、5.88%和9.52%。结果表明：砖块作为一种固定化材料可有效提高糖丁基梭菌的发酵产丁醇水平。

关键词：糖丁基梭菌丁醇固定化细菌吸附有机溶剂砖块

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基于膜压力应答途径的大肠杆菌丁醇耐受性

微生物学报 2018年第1期58卷 154-165页

作者：吴安宁许国超韩瑞枝董晋军倪晔江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

【目的】筛选丁醇压力下Escherichia coli中参与溶剂压力应答的细胞信号传导途径,并从应答途径出发,提高***丁醇耐受性。【方法】在丁醇压力下,利用RT-PCR分析大肠杆菌内膜压力应答途径中反应调节因子(response regulator,RR)的表达水平... 详细信息

【目的】筛选丁醇压力下Escherichia coli中参与溶剂压力应答的细胞信号传导途径,并从应答途径出发,提高***丁醇耐受性。【方法】在丁醇压力下,利用RT-PCR分析大肠杆菌内膜压力应答途径中反应调节因子(response regulator,RR)的表达水平,通过Red同源重组以及一步克隆的方法分别构建外膜脂蛋白Nlp E和分子伴侣蛋白Spy的敲除菌株*** JM109(Δnlp E)和*** JM109(Δspy)及重组菌株*** JM109/p QE80L-nlp E和*** JM109/p QE80L-spy,并测定其溶剂耐受性和细胞膜疏水性。【结果】0.8%(V/V)丁醇处理10 h后,Cpx和Bae双组分压力应答途径中的cpx R和bae R基因的表达水平分别提高了8.3和3.3倍;分别在含0.6%(V/V)四氢呋喃、0.1%(V/V)甲苯和0.6%(V/V)环己烷的培养基中培养10 h后,重组菌株*** JM109/p QE80L-spy和*** JM109/p QE80L-nlp E的OD600相比对照组(OD600增长0.02-0.04)分别增长了0.13-0.17和0.05-0.13,重组菌的溶剂耐受性得到了显著提高。【结论】Cpx和Bae系统参与大肠杆菌丁醇压力应答,分子伴侣蛋白Spy的过表达能够有效提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性,本研究为阐明微生物有机溶剂耐受性机制提供了理论依据。

关键词：丁醇压力应答途径大肠杆菌有机溶剂耐受性

arcA基因提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性

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微生物学通报 2016年第1期43卷 17-25页

作者：张法韩瑞枝许国超董晋军倪晔江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

【目的】将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida JUCT1)的基因arc A(编码精氨酸脱亚胺酶)整合到Escherichia coli JM109(DE3)基因组中,以提高该菌对有机溶剂的耐受性。【方法】以*** JUCT1的基因组为模板扩增基因arc A,并与p ET-20b... 详细信息

【目的】将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida JUCT1)的基因arc A(编码精氨酸脱亚胺酶)整合到Escherichia coli JM109(DE3)基因组中,以提高该菌对有机溶剂的耐受性。【方法】以*** JUCT1的基因组为模板扩增基因arc A,并与p ET-20b(+)连接后导入*** JM109(DE3)中,验证该基因提高*** JM109(DE3)对有机溶剂的耐受性。利用Red同源重组的方法将arc A整合到*** JM109(DE3)基因组中。【结果】*** JM109(DE3)/p ET-20b(+)-arc A在添加了2.0%(体积比)环己烷、0.1%(体积比)甲苯、4.0%(体积比)萘烷和0.1%(体积比)丁醇的培养基中培养8 h后,其OD660由初始的0.2分别上升到0.8、0.9、1.8和1.3。将arc A成功整合到*** JM109(DE3)基因组中,获得了具有较好遗传稳定性的溶剂耐受*** JM109(DE3)宿主菌株。【结论】外源基因arc A能提高大肠杆菌菌株的有机溶剂耐受性,为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。

关键词：精氨酸脱亚胺酶 Red同源重组有机溶剂耐受性恶臭假单胞菌大肠杆菌

3-磷酸甘油醛脱氢酶促进谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸

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食品与发酵工业 2019年第15期45卷 9-16页

作者：阚宝军董晋军刘晖占米林许国超韩瑞枝倪晔江南大学生物工程学院生物催化与酶工程研究室江苏无锡214122 工业生物技术教育部重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122

在谷氨酸棒状杆菌( Corynebacterium glutamicum )SNK118中表达NADP +依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因,提高胞内NADPH水平,以提高 L -精氨酸( L -Arginine)和 L -鸟氨酸(L-Ornithine)发酵产量。通过NCBI数据库检索,选取了3个不同来... 详细信息

在谷氨酸棒状杆菌( Corynebacterium glutamicum )SNK118中表达NADP +依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因,提高胞内NADPH水平,以提高 L -精氨酸( L -Arginine)和 L -鸟氨酸(L-Ornithine)发酵产量。通过NCBI数据库检索,选取了3个不同来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因。经测定酶活力,最终选择糖丁基梭菌( Clostridium saccharobutylicum) DSM13864来源的NADP +依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因( CsgapC )。构建了产 L -精氨酸的重组菌SNK118/pXMJ19- CsgapC,当摇瓶发酵70 h时产 L -精氨酸11.55 g/L,糖酸转化率0.13 g/g,与对照菌SNK118/pXMJ19相比,精氨酸产量和糖酸转化率分别提高了26%和10.2%。在 L -鸟氨酸生产菌株SNK118Δ argF Δ argR 中重组表达 CsgapC,重组菌SNK118Δ argF Δ argR /pXMJ19- CsgapC 摇瓶发酵70 h产 L -鸟氨酸27.76 g/L,糖酸转化率0.274 g/g,与对照菌SNK118Δ argF Δ argR /pXMJ19相比, L -鸟氨酸产量和糖酸转化率分别提高了20.1%和15.6%。结果表明,异源表达 CsgapC 有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵生产 L -精氨酸和 L -鸟氨酸的水平。

关键词：谷氨酸棒状杆菌 3-磷酸甘油醛脱氢酶 NADPH L-精氨酸 L-鸟氨酸

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秸秆碱预处理液脱毒及其在丁醇发酵中的应用

食品与发酵工业 2020年第2期46卷 131-134页

作者：董晋军马宝剑龚磊韩瑞枝许国超周婕妤倪晔江南大学生物工程学院生物催化与酶工程研究室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

秸秆的碱预处理液可造成严重的环境污染。该研究基于源头控制的理念,对碱预处理液进行脱毒工艺研究并回收进行丁醇发酵研究。通过加酸去除碱预处理液中的木质素,用活性炭将去除木质素的预处理液脱毒并用于水解和发酵过程。优化获得沉淀... 详细信息

秸秆的碱预处理液可造成严重的环境污染。该研究基于源头控制的理念,对碱预处理液进行脱毒工艺研究并回收进行丁醇发酵研究。通过加酸去除碱预处理液中的木质素,用活性炭将去除木质素的预处理液脱毒并用于水解和发酵过程。优化获得沉淀碱溶性木质素的最佳pH 3.8;不同加量活性炭脱毒后的碱预处理液对秸秆水解的影响不明显,然而活性炭的添加量对丁醇发酵影响较大,当活性炭添加量为15 g/L时,发酵72 h达到最高丁醇质量浓度10.2 g/L。该秸秆碱预处理液脱毒工艺对利用秸秆进行无废生产生物燃料有一定参考价值。

关键词：玉米秸秆预处理液木质素脱毒丁醇