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桔梗皂苷D联合伊马替尼对白血病耐药细胞K562/R的抑制增殖和作用机制研究

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中国中药杂志 2018年第2期43卷 385-389页

作者：代群葛宇清浙江中医药大学附属第一医院

桔梗皂苷D（platycodin D,PD）对多种恶性肿瘤有显著抑制作用,对白血病细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡的作用,但其是否有效提高耐药细胞对伊马替尼的敏感性及其发挥功能的分子机制仍未阐明。为了研究PD与伊马替尼（imatinib,IM）联合... 详细信息

桔梗皂苷D（platycodin D,PD）对多种恶性肿瘤有显著抑制作用,对白血病细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡的作用,但其是否有效提高耐药细胞对伊马替尼的敏感性及其发挥功能的分子机制仍未阐明。为了研究PD与伊马替尼（imatinib,IM）联合用药对慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/R的作用及机制。细胞增殖实验检测桔梗皂苷D对伊马替尼增殖抑制功能的影响,采用CCK8测定PD和IM单药及联合用药对K562/R增殖的抑制作用;流式细胞术检测Annexin V-FITC/PI双标记细胞凋亡率的变化,Western blot法检测cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,PARP,cleaved PARP,Bcr/abl,p-AKT,p-mTOR蛋白表达。结果显示桔梗皂苷D联合伊马替尼对K562/R细胞的增殖抑制作用和细胞凋亡率比单独用药组效果明显。Western blot法检测结果显示与单药组比较,联合用药组可以明显上调cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,cleaved PARP蛋白表达,同时下调PARP,Bcr/abl,p-AKT,p-mTOR蛋白的表达。结果表明桔梗皂苷D可以提高耐药细胞对伊马替尼的敏感性,联合用药在抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制Bcr/abl蛋白和激活PI3K/AKT/mTOR信号通路方面明显优于单独用药。

关键词：桔梗皂苷D 伊马替尼 K562/R Bcr/abl融合基因 PI3K/AKT/mTOR信号途径

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隐丹参酮对K562细胞凋亡的影响及其机制

中草药 2013年第22期44卷 3188-3194页

作者：葛宇清杨波程汝滨黄真陈喆浙江中医药大学第一临床医学院浙江杭州310006 浙江中医药大学药学院浙江杭州310053

目的探讨隐丹参酮诱导人慢性髓系白血病K562细胞凋亡的作用及其线粒体途径相关机制。方法 MTT法检测隐丹参酮对细胞增殖的抑制作用;Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测丹参酮对细胞凋亡的影响,DAPI染色法观察细胞形态的变化;Western... 详细信息

目的探讨隐丹参酮诱导人慢性髓系白血病K562细胞凋亡的作用及其线粒体途径相关机制。方法 MTT法检测隐丹参酮对细胞增殖的抑制作用;Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测丹参酮对细胞凋亡的影响,DAPI染色法观察细胞形态的变化;Western blotting检测丹参酮对细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、PARP、Bax、Bcl-2和细胞色素C(Cyt C)表达的影响,线粒体膜电位检测试剂盒检测丹参酮对线粒体膜电位的影响;检测线粒体膜通透性转运孔(PTP)抑制剂环孢霉素A和caspase抑制剂z-VAD-fmk对隐丹参酮药效的影响。结果隐丹参酮对K562细胞的生长有显著抑制作用,可引起细胞形态发生明显改变,诱导细胞发生凋亡,提高蛋白Bax/Bcl-2的比例,降低线粒体膜电位,促进Cyt C从线粒体释放到胞浆,增强促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9和PARP的活性。环孢霉素A和cz-VAD-fmk均能减弱隐丹参酮抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。结论隐丹参酮可显著诱导K562细胞凋亡,其机制与线粒体凋亡途径密切相关。

关键词：隐丹参酮 K562细胞细胞增殖细胞凋亡线粒体途径

O-GlcNAc糖基转移酶对小鼠乳腺癌细胞迁移的影响

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O-GlcNAc糖基转移酶对小鼠乳腺癌细胞迁移的影响

作者：葛宇清中国海洋大学

学位级别：硕士

糖链及其缀合物不仅参与生命活动的基本生理生化过程,而且在疾病的发生和发展中发挥着重要作用。肿瘤细胞中的糖链与正常细胞相比有明显变化,包括表达过量或减少、出现新的结构等。糖链的合成没有模板,而是通过一系列定位有序的糖基转... 详细信息

糖链及其缀合物不仅参与生命活动的基本生理生化过程,而且在疾病的发生和发展中发挥着重要作用。肿瘤细胞中的糖链与正常细胞相比有明显变化,包括表达过量或减少、出现新的结构等。糖链的合成没有模板,而是通过一系列定位有序的糖基转移酶完成的,糖基转移酶表达差异将直接导致糖链结构的变化。因此,从糖基转移酶入手可以从本质上阐明糖链在肿瘤发生和发展过程中的变化规律及调控作用。本实验以组织来源相同但转移能力不同的三株小鼠乳腺癌细胞67NR、4TO7、4T1为研究对象,利用基因芯片、实时定量PCR等技术系统地研究了小鼠迄今已知糖基转移酶在不同转移能力的肿瘤细胞中的表达谱和差异表达谱,发现了19个差异表达的糖基转移酶基因,它们可能与肿瘤的转移具有相关性。其中O-GlcNAc糖基转移酶(O-GlcNAc transferase, OGT)在不转移的67NR细胞中低表达,而在高转移的4T1细胞中高表达,其表达量为67NR的1.64倍。O-GlcNAc糖基转移酶主要对细胞质和核内蛋白质进行O- GlcNAc修饰。OGT蛋白含有两个功能结构域,氨基端的三十四肽重复序列(tetratricopeptiderepeat, TPR)和羧基端的催化结构域。O-GlcNAc修饰是一种动态的、可诱导的、可调控的修饰方式,与磷酸化相似。迄今发现的O-GIcNAc修饰蛋白都具有磷酸化修饰,而且其修饰位点常与磷酸化位点相同或相邻,即两种修饰方式之间存在相互影响。由于O-GIcNAc修饰与磷酸化修饰的“阴-阳”关系,O-GIcNAc修饰在许多生理和病理过程中发挥重要要作用。为探讨OGT在肿瘤细胞行为学方面的作用,我们利用RNA干扰技术在高转移的4T1细胞中抑制OGT基因的表达。通过实时荧光定量PCR技术、流式细胞技术检测RNA干扰对OGT基因表达的干扰效率;观察OGT干扰后细胞形态变化,并在体外检测了细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力。实验发现在4T1细胞中OGT基因沉默后,细胞增殖能力没有变化,迁移和侵袭能力有明显减弱。体外实验结果提示我们,O-GlcNAc修饰变化在肿瘤细胞迁移和侵袭中发挥重要作用。总之,本研究利用基因芯片技术系统地研究了不同转移能力的肿瘤细胞株中糖基转移酶的表达谱,发现了OGT等19个差异表达的糖基转移酶基因;并通过体外实验初步阐明了OGT促进小鼠乳腺肿瘤细胞的迁移和侵袭;为深入地研究糖基转移酶在肿瘤的发生和发展过程中的作用创造了条件。

关键词： O-GlcNAc糖基转移酶肿瘤细胞迁移基因芯片 RNA干扰

基于数据分析中药复方治疗胰腺癌用药特点与组方规律

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浙江临床医学 2022年第1期24卷 3-6页

作者：沈清金磊董姝洁葛宇清黄真程汝滨浙江中医药大学药学院 310053 浙江中医药大学第一临床医学院 310053

目的应用系统聚类和Apriori算法对治疗胰腺癌中药方剂的用药特点和组方规律进行数据分析,为临床治疗胰腺癌的药物组方和中成药开发提供数据参考.方法基于胰腺癌的中医核心病机,从《中医方剂大辞典》中以"积聚""癥瘕""黄疸""伏梁"四个病... 详细信息

目的应用系统聚类和Apriori算法对治疗胰腺癌中药方剂的用药特点和组方规律进行数据分析,为临床治疗胰腺癌的药物组方和中成药开发提供数据参考.方法基于胰腺癌的中医核心病机,从《中医方剂大辞典》中以"积聚""癥瘕""黄疸""伏梁"四个病证关键词,收集胰腺癌治疗的中药方剂,以关联支持度、置信度、提升度为指标,对胰腺癌治疗方剂中的高频中药、配伍规律、核心药物组合、关系网络图及聚类结果进行分析.结果共筛选获得中药方剂956首,涉及中药609味,总用药频次5,513次,使用频次≥100的中药共有21味,频次最高的5味中药分别是大黄、肉桂、木香、三棱和当归,功效以活血化瘀药使用频次最高;治疗胰腺癌的中药药性以温、寒为主,药味以辛、苦为主,归经以脾、肝与胃为主;使用频次较高的核心药物组合包括木香-槟榔、栀子-茵陈、三棱-莪术和肉桂-干姜等11个药对组合和木香-槟榔-三棱、三棱-莪术-木香、木香-槟榔-肉桂和莪术-陈皮-三棱等21个三药组合,关联规则分析发现了22种具有潜在配伍关系的胰腺癌治疗药物组合,其中提升度>7.0的药物组合有10个;聚类分析结果表明,高频使用的单味药物之间,具有关联性的药物组合有9组,大黄与巴豆分别单独聚为一支;高频药物复杂网络分析表明,药物槟榔、木香、三棱、莪术和药物肉桂、大黄、当归、木香间的联系密切.结论高频药物和核心组方中以活血药、理气药和利水渗湿药为主,活血化瘀、理气健脾与利湿退黄为中医药胰腺癌的主要治法,可以为胰腺癌的临床用药和新药开发提供理论支持和数据参考.

关键词：中药方剂胰腺癌用药特点组方规律数据分析

隐丹参酮对白血病细胞伊马替尼敏感性和P-糖蛋白表达作用的研究

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中国中药杂志 2015年第12期40卷 2389-2395页

作者：葛宇清程汝滨杨波黄真陈喆浙江中医药大学第一临床医学院浙江杭州310006 浙江中医药大学药学院浙江杭州310053

隐丹参酮是丹参中主要的脂溶性活性化合物之一,对白血病等多种恶性肿瘤有显著的抑制作用,并可有效提高伊马替尼的化疗效果,但其发挥功能的分子机制仍未阐明。该文利用白血病细胞K562及其伊马替尼耐药株K562-R,系统研究了隐丹参酮对细胞... 详细信息

隐丹参酮是丹参中主要的脂溶性活性化合物之一,对白血病等多种恶性肿瘤有显著的抑制作用,并可有效提高伊马替尼的化疗效果,但其发挥功能的分子机制仍未阐明。该文利用白血病细胞K562及其伊马替尼耐药株K562-R,系统研究了隐丹参酮对细胞伊马替尼的敏感性和P-糖蛋白表达的影响。利用MTT法检测隐丹参酮对伊马替尼增殖抑制功能的影响,Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡率的变化,Western blot检测细胞凋亡调控蛋白Caspase-3,Caspase-9,PARP的活性变化情况;梯度浓度的隐丹参酮处理细胞后,Western blot和流式细胞仪检测细胞中P-糖蛋白的表达水平变化,高效液相色谱法检测伊马替尼的胞内药物浓度的变化。结果隐丹参酮预处理后,显著增强了伊马替尼对K562和K562-R细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,细胞的促凋亡蛋白Caspase-3,Caspase-9,PARP的降解产物表达水平显著提高,与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。而隐丹参酮对白血病细胞中P-糖蛋白表达和伊马替尼胞内药物积累没有影响。结果表明隐丹参酮可提高CML细胞对伊马替尼的化疗敏感性,其作用机制不依赖于对P-糖蛋白表达的抑制和胞内药物浓度的提高。

关键词：隐丹参酮伊马替尼敏感性白血病 P-糖蛋白

白芍中芍药苷及其衍生物的UPLC-MS/MS分析

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中国中药杂志 2011年第12期36卷 1641-1643页

作者：郑敏霞陈喆刘培葛宇清代群浙江中医药大学附属第一医院国家中医临床研究基地浙江杭州310006

目的：采用超高效液相色谱与四级杆-线性离子阱串联质谱联用技术（UPLC-Q-Trap MS-MS）对白芍中单萜糖苷类成分进行分析和鉴别。方法：用Acquity UPLC BEH C18色谱柱,以0.1%甲酸水溶液（A）乙腈（B）为流动相梯度洗脱,使用ESI离子源,在... 详细信息

目的：采用超高效液相色谱与四级杆-线性离子阱串联质谱联用技术（UPLC-Q-Trap MS-MS）对白芍中单萜糖苷类成分进行分析和鉴别。方法：用Acquity UPLC BEH C18色谱柱,以0.1%甲酸水溶液（A）乙腈（B）为流动相梯度洗脱,使用ESI离子源,在负离子模式下采集数据,数据采集范围m/z100~1200,雾化气124.11 kPa,脱溶剂气103.43 kPa,气帘气206.85kPa;离子源温度为450℃;离子喷雾电压为-4.5 kV;结果：白芍中化学成分获得了较好的分离和检测,共推测出6个糖苷类化合物的化学结构;结论：该方法灵敏度高,分离度好,适用于白芍中单萜糖苷类成分的快速分析与结构鉴定。

关键词：白芍单萜糖苷超高效液相色谱质谱联用法

《中国药典》收载海马药材及其同属近源混伪品的HPLC指纹图谱研究

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时珍国医国药 2021年第2期32卷 349-352页

作者：王琪瑞葛宇清张光霁程汝滨浙江中医药大学药学院浙江杭州310053 浙江中医药大学第一临床医学院浙江杭州310006

目的比较2015年版《中国药典》收载的正品海马及其市场上常见的同属近缘混伪品海马的HPLC化学指纹图谱的差异,为不同品种海马药材的鉴定提供数据和参考,同时为海马药材的质量标准控制技术研究奠定基础。方法利用75%乙醇获得5种药典收录... 详细信息

目的比较2015年版《中国药典》收载的正品海马及其市场上常见的同属近缘混伪品海马的HPLC化学指纹图谱的差异,为不同品种海马药材的鉴定提供数据和参考,同时为海马药材的质量标准控制技术研究奠定基础。方法利用75%乙醇获得5种药典收录正品海马和5种市场常见的非药典品种海马的海马提取液,采用HPLC法建立10种不同海马样品提取液的指纹图谱,分析比较不同海马品种指纹图谱的差异,明确药典海马正品及其伪品的指纹图谱的鉴定特征,利用SPSS软件对不同海马样品的指纹图谱进行聚类分析。结果通过指纹图谱共获得了区分度较好的9个特征峰数据,不同的海马品种的指纹图谱中各个特征峰的组成和比例存在显著差异,SPSS聚类分析结果表明HPLC指纹图谱可将不同品种的海马进行准确高效区分。结论HPLC指纹图谱能有效区分不同的海马品种来源,鉴定结果具有快速、准确和操作简单的特点,本研究为控制海马药材商品的质量提供了技术保障。

关键词：海马药材指纹图谱近缘混伪品鉴别

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胰腺癌药物治疗的现状与展望

中国中药杂志 2019年第8期44卷 1509-1516页

作者：方昀来梦茹葛宇清张光霁程汝滨浙江中医药大学药学院浙江杭州310053 浙江中医药大学第一临床医学院浙江杭州310006

胰腺癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,其近年来的发病率呈逐年上升趋势,具有临床表现隐匿、发展迅速和预后差的特点。大多数患者由于早期的诊断困难而失去了手术机会,以吉西他滨为基础的化疗方案和放疗手段对患者的治疗效果欠佳,迫切需... 详细信息

胰腺癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,其近年来的发病率呈逐年上升趋势,具有临床表现隐匿、发展迅速和预后差的特点。大多数患者由于早期的诊断困难而失去了手术机会,以吉西他滨为基础的化疗方案和放疗手段对患者的治疗效果欠佳,迫切需要开发寻找有效安全的胰腺癌治疗药物。随着对胰腺癌细胞生物学和细胞信号途径等方面的深入研究,新的化疗药物方案、靶向治疗药物和免疫治疗药物不断涌现,部分药物和治疗方法的使用取得了令人鼓舞的效果。此外,中医药作为肿瘤治疗领域重要的替代和补充方法,在胰腺癌中显示了良好的应用前景。该文综述了胰腺癌的药物治疗现状,梳理了现有药物在使用过程中的优势和不足,对未来治疗有可能突破的方向进行了展望,为后续的药物开发提供新的思路和借鉴。

关键词：胰腺癌药物治疗中医药疗法综述

桔梗皂苷D诱导人肺癌细胞A549的凋亡及机制

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中国中药杂志 2012年第17期37卷 2626-2629页

作者：代群陈哲葛宇清刘培王海兵马小琼吴葆华浙江中医药大学附属第一医院国家中医临床研究基地浙江杭州310006 浙江大学附属第一医院浙江杭州310006

目的:研究桔梗皂苷D(platycodin,PD)抑制人肺癌A549细胞株增殖和诱导凋亡的分子机制。方法:体外培养人肺癌细胞株A549,PD作用终浓度分别为5～20μmol.L-1。MTT法测定PD对细胞的增殖抑制作用,显微镜观察细胞的形态学变化,Annexin V-FITC... 详细信息

目的:研究桔梗皂苷D(platycodin,PD)抑制人肺癌A549细胞株增殖和诱导凋亡的分子机制。方法:体外培养人肺癌细胞株A549,PD作用终浓度分别为5～20μmol.L-1。MTT法测定PD对细胞的增殖抑制作用,显微镜观察细胞的形态学变化,Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率,JC-1检测线粒体膜电位的变化,Western blot方法检测PD对Caspase-3,Caspase-9,PARP的剪切片段和Bax,Bcl-2,Bak,Bcl-xl蛋白表达的影响。结果:PD抑制A549细胞的增殖,并随药物浓度的增加和作用时间的延长,作用更显著;与对照组相比,不同浓度的PD作用24 h后,细胞凋亡率增加,线粒体膜电位降低,且差异显著。蛋白电泳检测结果显示蛋白Caspase-3,Caspase-9均出现剪切片断,并随着时间的增加断裂更明显。PD处理A549细胞后,Bax和Bak蛋白表达升高,Bcl-2和Bcl-xl蛋白表达下降。结论:PD具有明显的细胞毒作用,能诱导A549细胞凋亡,通过对Bax,Bak和Bcl-2,Bcl-xl表达的调控,导致线粒体膜电位的下降,进而激活Caspase最终导致肺癌细胞死亡。

关键词：桔梗皂苷D A549 线粒体膜电位细胞凋亡