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柔毛淫羊藿类黄酮异戊烯基转移酶基因的功能研究

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柔毛淫羊藿类黄酮异戊烯基转移酶基因的功能研究

作者：落艳娇山西医科大学

学位级别：硕士

目的:本文根据柔毛淫羊藿全基因组组装结果,全面挖掘和鉴定淫羊藿中的类黄酮异戊烯基转移酶基因,探索其进化关系,克隆候选基因并构建到酵母表达载体,通过酶学分析验证基因功能,以进一步解析淫羊藿苷类黄酮的生物合成途径,以及为体外合... 详细信息

目的:本文根据柔毛淫羊藿全基因组组装结果,全面挖掘和鉴定淫羊藿中的类黄酮异戊烯基转移酶基因,探索其进化关系,克隆候选基因并构建到酵母表达载体,通过酶学分析验证基因功能,以进一步解析淫羊藿苷类黄酮的生物合成途径,以及为体外合成该类化合物及定向培育高含量活性成分的淫羊藿药材提供依据。方法:本文的第一部分首先用柔毛淫羊藿基因组所有蛋白序列构建本地蛋白数据库,通过隐马尔可夫模型结合PFAM和NCBI Batch CD-search在线数据库,全面发掘其中的UbiA PTs。通过对进化关系、染色体位置、不同组织表达模式等进行分析,筛选类黄酮异戊烯基转移酶候选基因。接下来采用巢式PCR技术,以柔毛淫羊藿叶片cDNA为模板,对候选基因进行克隆,并对候选基因的序列结构、理化性质、跨膜结构域等序列特征进行分析,为后续基因的功能验证提供依据。本文第二部分对克隆得到的候选基因进行功能研究。首先扩增得到基因的完整蛋白编码序列EpPTs以及不含转运肽的截短基因序列EpPT?TPs,然后通过TOPO克隆反应构建pENTR/D-TOPO-EpPTs/EpPT?TPs入门载体,进而通过LR反应,构建pDR196GW-EpPTs/EpPT?TPs酵母表达载体,将构建好的酵母表达载体转入DD104型酵母感受态细胞中。经菌落PCR和测序确认,阳性酵母菌分别与推测的17种类黄酮底物孵育反应,用HPLC检测是否有产物峰出现。结果:根据柔毛淫羊藿基因组组装结果,共鉴定出24条含有UbiA保守结构域的PT序列,通过系统进化、不同组织表达模式和基因复制事件等分析,共发现11条可能的类黄酮异戊烯基转移酶候选基因序列（EVM0033754、EVM0036836、EVM0018117、EVM0011267、EVM0010669、EVM0011343、EVM0022490、EVM0029975、EVM0031923、EVM0032839和EVM0033386）,并推测淫羊藿中的类黄酮异戊烯基转移酶是由维生素E生物合成有关的基因进化而来。使用巢式PCR技术,从柔毛淫羊藿叶片cDNA中克隆得到7条基因序列:EpPT1a和EpPT1b（EVM0029975的两个不同转录本）,EpPT2（EVM0022490）,EpPT3（EVM0010669）,EpPT4～EpPT6（未在基因组中找到完整的基因组序列）。此外,EpPT7（EVM0032839）尝试多种方法均未能成功克隆得到全长,因此采用人工合成技术合成完整的蛋白编码序列。通过进一步生物信息学分析,8条EpPTs均具有植物类黄酮异戊烯基转移酶典型的序列特征。采用PCR技术克隆得到各基因的完整蛋白编码序列EpPTs以及不含转运肽的截短基因序列EpPT?TPs,构建pDR196GW（空载体）、pDR196GW-La PT2（阳性对照）、pDR196GW-EpPT2、pDR196GW-EpPT2?TP82、pDR196GW-EpPT2?TP32、pDR196GW-EpPT3、pDR196GW-EpPT3?TP51、pDR196GW-EpPT4?TP32、pDR196GW-EpPT5和pDR196GW-EpPT5?TP49共10个酵母表达载体并转入DD104型酵母菌株,进行后续的酶活性鉴定。结果发现其中一个候选基因EpPT2编码的蛋白,主要催化山奈酚与DMAPP生成异戊烯基山奈酚,此外还可催化槲皮素和芹菜素生成少量的产物,但与其余的14种类黄酮底物反应均未检测到产物。结论:本文以柔毛淫羊藿基因组组装结果为基础,对UbiA基因家族成员进行了详细的生物信息学分析,阐明了类黄酮异戊烯基转移酶的进化关系。结合分子克隆技术、酵母表达技术等,克隆并鉴定了一个黄酮醇异戊烯基转移酶基因EpPT2,其编码蛋白催化形成的主要产物是异戊烯基山奈酚,EpPT2可能是淫羊藿苷类活性成分生物合成的关键酶。本研究为进一步解析淫羊藿类黄酮生物合成途径提供依据,也为继续从淫羊藿中获得其他类黄酮异戊烯基转移酶奠定基础。

关键词：柔毛淫羊藿类黄酮异戊烯基转移酶基因家族生物信息学

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植物中异戊烯基取代的酚类化合物及其分布

西北植物学报 2023年第9期43卷 1604-1620页

作者：王圆月落艳娇张译心申国安郭宝林中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所北京100193

异戊烯基取代的酚类化合物由UbiA家族的异戊烯基转移酶(prenyltransferase)催化异戊烯基转移到芳香族化合物母核上,其亲脂性较无异戊烯基取代的化合物明显增强,并提高了与生物膜的亲和力,从而形成了各种具有重要生物学功能的活性分子,... 详细信息

异戊烯基取代的酚类化合物由UbiA家族的异戊烯基转移酶(prenyltransferase)催化异戊烯基转移到芳香族化合物母核上,其亲脂性较无异戊烯基取代的化合物明显增强,并提高了与生物膜的亲和力,从而形成了各种具有重要生物学功能的活性分子,在植物防御和人体健康方面具有重要作用。本综述总结了538种异戊烯基酚类化合物的取代基类别和取代位点等,为发掘植物中新型异戊烯基转移酶,以及受体和供体的选择提供参考,以期有更多异戊烯基转移酶可应用于合成生物学来生产具有重要活性的异戊烯基酚类化合物。该文对国内外报道的378种类黄酮,80种香豆素类,27种醌类,32种二苯乙烯类,16种对羟基苯甲酸类,5种苯丙酸类共计538种异戊烯基取代的酚类化合物的取代基类别、取代位置以及在植物中的分布进行总结,发现异戊烯基酚类化合物主要分布在28个科中,且以C5和C10取代基为主。该文还综述了已鉴定功能的30余种植物芳香族异戊烯基转移酶。

关键词：异戊烯基酚类化合物异戊烯基转移酶

植物中UbiA膜结合型芳香族异戊烯基转移酶的研究进展

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植物科学学报 2023年第2期41卷 256-268页

作者：落艳娇王圆月庞永珍申国安郭宝林中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所中药生物活性物质与资源利用教育部重点实验室北京100193 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

UbiA膜结合型芳香族异戊烯基转移酶(Prenyltransferases,PT)可催化异戊烯基单元转移到芳香族母核上形成C-C(或C-O)键,在植物中参与合成重要的代谢产物,如泛醌、质体醌、叶绿素、生育酚等。植物中多种具有异戊烯基的芳香族次生代谢物也... 详细信息

UbiA膜结合型芳香族异戊烯基转移酶(Prenyltransferases,PT)可催化异戊烯基单元转移到芳香族母核上形成C-C(或C-O)键,在植物中参与合成重要的代谢产物,如泛醌、质体醌、叶绿素、生育酚等。植物中多种具有异戊烯基的芳香族次生代谢物也是该类酶作用的产物。异戊烯基的引入增加了天然产物结构多样性和生物活性。本文介绍了植物中UbiA家族的基本类型,归纳了57个已鉴定功能的与次生代谢物(类黄酮、香豆素、二苯乙烯等)合成相关的UbiA PTs底物选择性、催化特点及其与初生代谢相关PTs的系统发育关系,并对异戊烯基转移酶基因的挖掘策略,以及利用微生物代谢工程定向合成活性异戊烯基化合物的应用前景进行了展望。

关键词：异戊烯基转移酶初生代谢次生代谢生物合成

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紫苏叶不同栽培年份和采收期8种酚类成分含量研究

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中国中药杂志 2021年第3期46卷 567-574页

作者：落艳娇郭佳琪李卫萍姚宇温春梅郭宝林中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所北京100193 山西医科大学药学院山西太原030001

该文建立了同时测定紫苏叶中迷迭香酸(RA)和咖啡酸(CA)2种酚酸,野黄芩素-7-O-二葡萄糖醛酸苷(SDG)、木犀草素-7-O-二葡萄糖醛酸苷(LDG)、芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷(ADG)、野黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷(SG)、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷(LG... 详细信息

该文建立了同时测定紫苏叶中迷迭香酸(RA)和咖啡酸(CA)2种酚酸,野黄芩素-7-O-二葡萄糖醛酸苷(SDG)、木犀草素-7-O-二葡萄糖醛酸苷(LDG)、芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷(ADG)、野黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷(SG)、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷(LG)、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(AG)6种黄酮含量的方法。基于10份包括不同挥发油化学型的紫苏种质,以及不同栽培年份和不同采收期的材料,测定上述8种成分的含量。结果表明不同种质间酚酸总含量和黄酮总含量差异大,2种酚酸总量为2.24~34.44 mg·g^(-1),6种黄酮总量为11.55~34.71 mg·g^(-1)。各成分按照含量由多到少的顺序为RA 2.13~33.97 mg·g^(-1),LDG 1.31~14.80 mg·g^(-1),SG 1.97~8.45 mg·g^(-1),ADG 2.68~7.60 mg·g^(-1),SDG 1.16~5.87 mg·g^(-1),LG 0.78~1.91 mg·g^(-1),AG 0.56~1.00 mg·g^(-1),CA 0.11~0.68 mg·g^(-1)。5份PA型种质中多数成分的含量在2017年高于2018年,表现出不同栽培年份变化较大。9份种质的2种酚酸类成分含量随采收时间的变化,在穗前期(8月3日—8月18日)先降低,在开花结实期,8月18日—9月2日开始升高,9月2日—9月17日有缓慢降低趋势,在果熟期再次升高;而6种黄酮类成分的含量在不同种质中随采收时间变化趋势不一致。部分种质中黄酮类与酚酸类成分的变化呈现负相关,酚酸类成分的变化和挥发油化学型构成没有相关性。该论文为高品质紫苏药材的栽培提供参考。

关键词：紫苏叶酚酸含量黄酮含量迷迭香酸不同采收期不同栽培年份

不同光强对拟巫山淫羊藿光合生理特性及叶绿素荧光参数的影响

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中药材 2020年第4期43卷 813-816页

作者：李小明潘俊倩落艳娇徐超群魏升华郭宝林贵州中医药大学药学院贵州贵阳550025 中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所北京100193 军事医学研究院辐射医学研究所北京100850 山西医科大学山西太原030001

目的:在持续的不同光强条件下,分析拟巫山淫羊藿光合生理及叶绿素荧光参数对不同处理方法的适应性变化,确定该植物的最佳光照强度。方法:在L1[9.1±2.5μmol/(m^(2)·s)]、L2[18.2±2.5μmol/(m^(2)·s)]、L3[90.9±2.5μmol/(m^(2)·s)... 详细信息

目的:在持续的不同光强条件下,分析拟巫山淫羊藿光合生理及叶绿素荧光参数对不同处理方法的适应性变化,确定该植物的最佳光照强度。方法:在L1[9.1±2.5μmol/(m^(2)·s)]、L2[18.2±2.5μmol/(m^(2)·s)]、L3[90.9±2.5μmol/(m^(2)·s)]和L4[163.6±2.5μmol/(m^(2)·s)]4种光强下,采用LI-6400便携式光合作用测定仪检测了拟巫山淫羊藿植株在萌芽后持续处理60 d的光响应曲线和叶绿素荧光参数。结果:在L2和L3光强持续处理60 d后其光响应曲线较高。随着处理光强从L1增大到L4,光合能力(P_(max))和光饱和点(LSP)呈现先升高后降低的趋势,L2下植物的Pmax最大,L2和L3下植物的LSP较大;光补偿点(LCP)呈现逐渐升高的趋势而表观量子效率(AQE)则呈现逐渐降低然后基本不变的趋势。叶绿素荧光参数结果表明,随着处理光强的增大,PSⅡ实际光能利用效率[Y(Ⅱ)]、电子传递速率(ETR)和光化学猝灭参数(qP)等各项指标均呈现出逐渐降低然后基本不变的趋势,即处理光强从L1增大到L4,其光能利用能力先逐渐降低然后基本不变。结论:拟巫山淫羊藿在(18.2±2.5)~(90.9±2.5)μmol/(m^(2)·s)的光强范围内,其在多种光合和荧光参数上均有较好的光合表现,栽培时可根据此范围光强对拟巫山淫羊藿进行遮荫处理。

关键词：拟巫山淫羊藿光强光响应曲线叶绿素荧光参数

不同光强下光质对拟巫山淫羊藿生长发育和淫羊藿苷类黄酮含量的影响

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中国中药杂志 2020年第11期45卷 2502-2508页

作者：李小明潘俊倩落艳娇杨倩茹徐超群申国安魏升华郭宝林贵州中医药大学药学院贵州贵阳550025 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所北京100093 军事医学研究院辐射医学研究所北京100850 山西医科大学山西大原030001

该研究在(18.2±2.5)μmol·m^-2·s^-1(L1)和(90.9±2.5)μmol·m^-2·s^-1(L2)2种光强下,以白光为对照,设置红光、蓝光和黄光3种光质处理,在处理30,60 d测定拟巫山淫羊藿的生长发育指标及淫羊藿苷类黄酮成分,研究光质对拟巫山淫羊藿... 详细信息

该研究在(18.2±2.5)μmol·m^-2·s^-1(L1)和(90.9±2.5)μmol·m^-2·s^-1(L2)2种光强下,以白光为对照,设置红光、蓝光和黄光3种光质处理,在处理30,60 d测定拟巫山淫羊藿的生长发育指标及淫羊藿苷类黄酮成分,研究光质对拟巫山淫羊藿生长发育和黄酮类成分积累的影响机制。结果表明,拟巫山淫羊藿在L1光强下,蓝光显著降低叶片面积,而对茎高度作用较小,红光和黄光则对于茎高和叶片作用不明显,但黄光能显著增加新的茎枝萌发,且具有持续促进作用,60 d时,生物量最高;红光、蓝光和黄光下淫羊藿苷类黄酮含量均高于白光,而以黄光最高,是白光的1.8,1.9倍(30,60 d)。L2光强下,强光促进茎萌发的作用成为主效因子,黄光促进茎萌发的效果变得不显著,而红光显著降低叶面积;白光促进淫羊藿苷类成分合成的效果强于红光、蓝光和黄光。当强光处理时间加长时,其他光处理淫羊藿苷类成分出现降解,红光反而较大幅度促进黄酮类成分的合成。该结果支持在生产中,提供适当的红光和黄光,可提高生物量,且同时提高黄酮类含量。

关键词：拟巫山淫羊藿光质光强发育时期生长淫羊藿苷类黄酮

PA型紫苏不同部位8种酚酸和黄酮类成分的含量相关性研究

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中国中药杂志 2022年第13期47卷 3447-3451页

作者：张琛武郭佳琪李卫萍落艳娇姚宇徐超群申国安索风梅郭宝林山西药科职业学院山西太原030031 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所北京100193

该研究选取了10份PA型紫苏种质,检测叶、茎和果实3个不同部位,分别对应紫苏叶、紫苏梗和紫苏子3种药材中含量较高的2种酚酸[迷迭香酸(RA)和咖啡酸(CA)]以及6种黄酮[野黄芩素-7-O-二葡萄糖醛酸苷(SDG)、木犀草素-7-O-二葡萄糖醛酸苷(LDG... 详细信息

该研究选取了10份PA型紫苏种质,检测叶、茎和果实3个不同部位,分别对应紫苏叶、紫苏梗和紫苏子3种药材中含量较高的2种酚酸[迷迭香酸(RA)和咖啡酸(CA)]以及6种黄酮[野黄芩素-7-O-二葡萄糖醛酸苷(SDG)、木犀草素-7-O-二葡萄糖醛酸苷(LDG)、芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷(ADG)、野黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷(SG)、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷(LG)、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(AG)]的含量。叶中酚酸总量为3.991~12.028 mg·g^(-1)、黄酮总量为12.309~25.071 mg·g^(-1),远远大于茎(分别为0.586~2.015、0.879~1.413 mg·g^(-1))和果实(分别为0.004~2.222、0.651~1.936 mg·g^(-1))。酚酸类成分中有5份果实中未能检测出RA,其余5份对应样品中紫苏叶与果实之间RA含量均呈现显著负相关。黄酮类成分茎中仅能检测出LG和LDG,果实中缺失SG和SDG,而其他几种黄酮也在部分样品中未能检出,叶和果实的总黄酮、LG含量呈现显著正相关,茎和果实的LG含量呈现显著正相关。10份茎样本中,有7份达到了《中国药典》(2020年版)规定的紫苏梗迷迭香酸不低于0.1%的标准。而仅1份果实达到药典规定的紫苏子迷迭香酸不低于0.25%的标准。

关键词： PA型紫苏叶茎果实酚酸黄酮含量相关性

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植物花青素糖基转移酶研究进展

生物资源 2023年第3期45卷 201-209页

作者：顾佳珺姚宇落艳娇王圆月申国安张丽娟郭宝林天津中医药大学中药学院天津301617 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所、中药生物活性物质与资源利用教育部重点实验室北京100193

花青素是植物体内重要的次生代谢物,具有较强的药理活性,如抗氧化、抗癌等,广泛用于营养保健领域。自然条件下,植物体内的花青素以糖苷形式存在,带有各种糖基化修饰,而花青素糖基转移酶是专门负责催化这种糖基化反应的酶,能够把糖基供... 详细信息

花青素是植物体内重要的次生代谢物,具有较强的药理活性,如抗氧化、抗癌等,广泛用于营养保健领域。自然条件下,植物体内的花青素以糖苷形式存在,带有各种糖基化修饰,而花青素糖基转移酶是专门负责催化这种糖基化反应的酶,能够把糖基供体转移到花青素不同的位点,形成了不同的花青素种类,从而改变这些分子的特性,影响生物活性和药用功能。本文重点综述了植物花青素糖基转移酶的分类和修饰反应特点,以及主要花青素资源植物中糖基转移酶的研究进展,有助于深入挖掘和鉴定植物中花青素相关糖基转移酶,解析其催化和调控机理,为花青素生物合成、富含花青素的植物资源研发提供新的思路。

关键词：花青素花青素资源植物糖基转移酶生物合成基因工程

浙江省老年医学科住院患者营养一日调查及影响因素分析

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中华老年医学杂志 2024年第9期43卷 1180-1190页

作者：吴迪菲俞曦艳陈旭娇浙江大学医学院杭州310058 浙江中医药大学第二临床医学院杭州310053 浙江中医药大学附属第一医院(浙江省中医院)老年医学科杭州310003

目的对浙江地区老年医学科住院患者展开营养一日调查研究,评估老年住院患者营养与健康状况,并对老年住院患者营养现状及影响因素进行相关性分析,为临床干预提供证据支持。方法本研究为多中心横断面研究。通过典型抽样,对浙江地区42家医... 详细信息

目的对浙江地区老年医学科住院患者展开营养一日调查研究,评估老年住院患者营养与健康状况,并对老年住院患者营养现状及影响因素进行相关性分析,为临床干预提供证据支持。方法本研究为多中心横断面研究。通过典型抽样,对浙江地区42家医疗单位的老年医学科住院患者进行营养一日调查,以问卷形式调查其人口统计学资料,记录24 h膳食摄入并计算总热量及总蛋白质摄入量,进行营养相关老年综合征筛查,采集实验室数据等。运用SPSS 25.0软件分析不同营养状况组间差异,对影响老年住院患者营养现状的可能因素进行分析。结果共调查老年住院患者332例,收集有效问卷325份(97.9%)。营养不良组30例(9.2%);营养不良风险组120例(36.9%);营养正常组175例(53.8%)。37.8%(123例)的老年住院患者达到了推荐蛋白质每日最低摄入量1g/(kg·d)。矫正混杂因素后,多因素Logistic回归分析结果显示较短的每日静坐时长(2~4 h)、独立行走、辅助行走、住院前进食量同平时、自我感觉健康状况好或一般是老年住院患者营养状况的保护因素,而缺齿(牙齿数目<5颗)则是危险因素。结论住院老年人院前生活情况、膳食摄入与营养状态密切相关,应重视对住院老年人的膳食评估以及营养评估,并对生活方式做出干预指导。

关键词：营养不良膳食住院