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基于竞争性杂交方法的猪-肠道微生物特异性互作靶点发掘

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2017年第2期43卷 163-172页

作者：樊丽华莫虹斐张晓峰帅江冰陈青浙江工商大学食品与生物工程学院杭州310035 浙江省检验检疫科学技术研究院杭州310016

动物肠道中存在着一些参与猪肠道微生物互作的基因,这些基因具有一定的宿主特异性,利用其设计分子标记能准确识别粪便污染来源。该文共采集6个物种(猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅)的145个粪便样品,提取其DNA后利用竞争性杂交的基因片段富集方... 详细信息

动物肠道中存在着一些参与猪肠道微生物互作的基因,这些基因具有一定的宿主特异性,利用其设计分子标记能准确识别粪便污染来源。该文共采集6个物种(猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅)的145个粪便样品,提取其DNA后利用竞争性杂交的基因片段富集方法(genome fragment enrichment,GFE),靶向筛选参与猪肠道微生物互作的特异性基因。经BLASTX分析发现,82%的猪特异性非冗余DNA片段存在相似序列,以拟杆菌纲(Bacteroidetes)(43.2%)、梭菌纲(Clostridia)(19.5%)、芽孢杆菌纲(Bacilli)(8.6%)相似序列为主。从蛋白质功能方面分析,61.5%的非冗余序列功能明确,有7.6%的序列与信息贮存及加工有关,12.8%的序列与细胞加工及信息传导有关,22%的序列与代谢有关,其中,碳水化合物和氨基酸的转移代谢相关序列含量最为丰富,均占总特异性序列的6.3%。研究发现,能够编码拟杆菌纲(Bacteroidetes)和梭菌纲(Clostridials)等表面蛋白、膜分泌蛋白及碳水化合物代谢蛋白的相关基因可作为猪特异性分子标记筛选的靶点。

关键词：非点源污染竞争性杂交特异性基因组片段富集功能注释猪特异性分子标记

J亚群禽白血病病毒gp85单抗1E3株抗原识别表位的初步分析

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中国兽医杂志 2011年第12期47卷 3-7页

作者：莫虹斐余多孙淼陈福勇曹红中国农业大学动物医学院北京海淀100193 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

J亚型禽白血病是由J亚群禽白血病病毒引起的一种以成髓细胞增生、免疫抑制、生长发育受阻为特点的传染性肿瘤疾病,于1988年首次发现,其病毒囊膜表面蛋白gp85决定了病毒亚群特异性。本试验将原核表达质粒pET-28a-J gp85中的gp85基因分段... 详细信息

J亚型禽白血病是由J亚群禽白血病病毒引起的一种以成髓细胞增生、免疫抑制、生长发育受阻为特点的传染性肿瘤疾病,于1988年首次发现,其病毒囊膜表面蛋白gp85决定了病毒亚群特异性。本试验将原核表达质粒pET-28a-J gp85中的gp85基因分段亚克隆至重组表达质粒pGEX-6p-1上并在大肠杆菌中成功地表达,用ALV-J S1gp85单克隆抗体1E3株对分段表达的gp85蛋白进行初步的免疫印迹分析。结果表明:ALV-J S1gp85单抗1E3株所识别的抗原表位位于蛋白N端的第69至112个氨基酸之间。这将为ALV-J gp85抗原决定簇所在位点及其免疫学功能的研究奠定基础。

关键词： J亚群禽白血病病毒 gp85蛋白单克隆抗体抗原表位

六种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测体系的构建

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微生物学报 2023年第9期63卷 3653-3666页

作者：张晓峰宋士琦曾若雪陈吴健莫虹斐王正亮帅江冰杭州海关技术中心浙江杭州311202 浙江省检验检疫科学技术研究院浙江杭州310016 中国计量大学生命科学学院浙江杭州310018

【目的】建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)多目标检测方法,同时对SIV进行通用型、H1型及H3型分型检测。【方法】本研究根据6种病原体基因的保守序列,设计了6对加标引物及对应的延伸探针并进行单反应试验。通过体系优化引物浓度和反应条件,以及方法特异性、重复性及灵敏度分析,使用MALDI-TOF MS检测方法及荧光定量PCR方法分别对临床样本和猪源产制品进行检测,并对结果进行对比验证。【结果】质谱结果显示,6种产物峰仅在靶标病毒对应的产物位置出现峰值,其他常见猪病病原在质谱图像中均未出现干扰,表明该体系的特异性良好。体系中每种病毒在高、中、低浓度时的批内阳性符合率均为100%,批间符合率均≥96.7%,表明该体系的重复性良好。灵敏度分析结果显示,体系中各病毒最低检测限在6.73–21.25拷贝/μL范围。应用MALDI-TOF MS多重检测方法对124份组织、饲料及猪肉样品进行检测,检出PRRSV阳性样本9份,SIV阳性样本3份(其中SIV-H1阳性样本2份,SIV-H3阳性样本1份)。将以上结果与荧光定量PCR方法分析结果进行对比验证,2种方法对各病原体检测结果的总符合率可达到99.2%–100%。【结论】本研究建立的6种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测方法为相关疫病监测和快速鉴别,以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。

关键词：猪呼吸道病毒基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) 高通量检测

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千帆隐映青山有路 002

抗J亚群禽白血病gp85蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

中国国门时报

作者：莫虹斐何永强吴姗

眼下，浙江检验检疫局技术中心生物安全实验室正在紧锣密鼓地准备迎接CNAS的验收评审，蚕病检测室正在筹划组织全国性蚕病检测技术交流会，分子诊断室正在开展进境截获的物种分子鉴定和市售肉制品的真伪鉴别……“将本职工作发挥得淋漓...

眼下，浙江检验检疫局技术中心生物安全实验室正在紧锣密鼓地准备迎接CNAS的验收评审，蚕病检测室正在筹划组织全国性蚕病检测技术交流会，分子诊断室正在开展进境截获的物种分子鉴定和市售肉制品的真伪鉴别……“将本职工作发挥得淋漓尽致，方能专业；用才华和汗水推进领域发?

关键词：

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抗J亚群禽白血病gp85蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

猪粪便污染特异性分子标记筛选及其PCR检测方法的建立

中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会

作者：余多莫虹斐曹红陈福勇中国农业大学动物医学院

禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由反转录病毒科禽白血病病毒和禽肉瘤病毒群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。J亚型禽白血病(subgroupJ avian leukosis)是由J亚型禽白血病病毒(Avianleukosis virus subgroup J,ALV-J)引起的一... 详细信息

禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由反转录病毒科禽白血病病毒和禽肉瘤病毒群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。J亚型禽白血病(subgroupJ avian leukosis)是由J亚型禽白血病病毒(Avianleukosis virus subgroup J,ALV-J)引起的一类以生长抑制、免疫抑制、髓细胞癌变为特点的禽类传染性

关键词： J亚型禽白血病 gp85蛋白单克隆抗体抗原检测分离鉴定

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环境科学学报 2017年第6期37卷 2085-2091页

作者：樊丽华帅江冰莫虹斐曾若雪金晨晨张晓峰陈青何永强浙江工商大学食品与生物工程学院杭州310035 浙江省检验检疫科学技术研究院杭州310016

肠道微生物群落在与其宿主长期协同进化过程中会形成大量的宿主-肠道微生物互作基因,这些互作基因具有一定的宿主肠道微生物特异性,利用其设计分子标记能有效识别粪便污染源.本研究首次利用竞争性杂交的方法富集猪粪便特异性基因,从中... 详细信息

肠道微生物群落在与其宿主长期协同进化过程中会形成大量的宿主-肠道微生物互作基因,这些互作基因具有一定的宿主肠道微生物特异性,利用其设计分子标记能有效识别粪便污染源.本研究首次利用竞争性杂交的方法富集猪粪便特异性基因,从中筛选出具有猪粪便特异性的基因片段,以此设计引物并建立相应的PCR检测方法,并对采集样进行应用调查.竞争性杂交富集的猪粪便特异性基因文库以拟杆菌群(Bacteroidetes)(43.2%)和梭状杆菌群(Clostridia)(19.5%)相似序列为主,其蛋白功能主要分为3大类:与信息贮存与加工有关(7.6%),与细胞加工及信息传导有关(12.8%)以及与代谢有关(22.0%).进一步针对功能蛋白序列筛选宿主粪便特异性分子标记.分析表明序列3-53-2对应引物可作为猪粪便污染的特异性分子标记,针对其建立的常规PCR方法对粪便DNA的检出限可低至0.01 ng·μL-1,且对实际样品具有较高的应用灵敏性(97%)和特异性.进一步对可能受污染水样进行猪粪便污染特异性检测,结果显示不同地区的阳性检出率高达75%~100%,证明了此方法的有效性,可为研究微生物示踪技术在非点源污染方面的应用提供一定的基础数据.

关键词：竞争性杂交宿主-微生物互作基因宿主粪便特异性分子标记常规PCR

反刍动物埃立克体荧光定量PCR检测技术的建立和应用

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畜牧兽医学报 2021年第7期52卷 1975-1982页

作者：王素华王忠才黄凌哲莫虹斐吴绍强吕继洲赵治国帅江冰温州海关综合技术服务中心温州325027 杭州海关技术中心杭州310012 中国检验检疫科学研究院动物检疫所北京100029 呼和浩特海关技术中心呼和浩特010020

为快速、准确地检测反刍动物埃立克体,本研究以反刍动物埃立克体pCS20为靶基因设计特异性引物和探针,建立了TaqMan和Eva Green荧光定量PCR方法,对其反应的特异性、敏感性和重复性进行了分析,并与OIE推荐的套式PCR方法一起对临床样品进... 详细信息

为快速、准确地检测反刍动物埃立克体,本研究以反刍动物埃立克体pCS20为靶基因设计特异性引物和探针,建立了TaqMan和Eva Green荧光定量PCR方法,对其反应的特异性、敏感性和重复性进行了分析,并与OIE推荐的套式PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示,本方法特异性强,与牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬埃立克体、牛埃立克体、马埃立克体和立氏埃立克体无交叉反应;TaqMan和Eva Green荧光定量PCR对pCS20质粒标准品的最低检测限分别为17.4拷贝·μL^(-1)和1.74拷贝·μL^(-1),标准曲线相关系数大于0.99,组内和组间CV均小于1.5%。对420只钝眼蜱样本的检测显示,TaqMan和Eva Green荧光定量PCR的检出率分别为25.48%和29.29%,与套式PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为反刍动物埃立克体的检测和流行病学调查提供了一种快速、准确的检测方法。

关键词：反刍动物埃立克体 pCS20基因 TaqMan荧光定量PCR Eva Green荧光定量PCR

浙江地区4型猪戊型肝炎病毒全基因组序列分析

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浙江地区4型猪戊型肝炎病毒全基因组序列分析

汉中市雏鸡群H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒混合感染的血清学诊断

第六届中国兽药大会

作者：何永强曾若雪莫虹斐帅江冰张晓峰浙江省检验检疫科学技术研究院

本研究采用套式RT-PCR方法首次对浙江省猪群中戊型肝炎病毒的全基因组进行分段扩增,并对其两端非编码区采用末端快速扩增法(RACE)进行扩增,T-A克隆测序后拼接分析。JH-14-03株全基因组共7253 bp,5’端至3’端依次为5’非编码区(25 bp)、... 详细信息

本研究采用套式RT-PCR方法首次对浙江省猪群中戊型肝炎病毒的全基因组进行分段扩增,并对其两端非编码区采用末端快速扩增法(RACE)进行扩增,T-A克隆测序后拼接分析。JH-14-03株全基因组共7253 bp,5’端至3’端依次为5’非编码区(25 bp)、ORF1基因(5124 bp)、ORF3基因(339 bp)、ORF2基因(1983)及包含一个18个碱基A组成的Poly(A)尾的3’非编

关键词：浙江省戊型肝炎病毒全基因组序列分析

来源： cnki会议评论

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动物医学进展 2012年第2期33卷 117-120页

作者：韩永刚莫虹斐徐小虎何建亮罗晓荣陈树林汉中市汉台区动物疫病预防控制中心陕西汉中723000 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 汉台区农村能源工作站陕西汉中723000

2011年1月至5月陕西省汉中市3个县区20日龄～40日龄的雏鸡群发生了12起疫情,给养殖场(户)造成了很大损失。为明确疫病的分布和流行特点,通过流行病学调查分析、血清学检查,确诊为低致病性H9亚型禽流感和典型新城疫混合感染。

关键词：雏鸡低致病性H9亚型禽流感新城疫血清学检查