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LAMP-CRISPR/Cas应用于禽类结构变异检测的方法研究及其评价

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LAMP-CRISPR/Cas应用于禽类结构变异检测的方法研究及其评价

作者：雷艳茹河南农业大学

学位级别：硕士

禽类基因组中的结构变异对物种的适应性演化和复杂性状形成具有重要影响。这些变异包括大片段DNA序列的插入、缺失、倒位和易位等,可以改变基因的编码序列和数量,同时影响调控元件如启动子和增强子的功能。目前已知禽类定位的经济性状... 详细信息

禽类基因组中的结构变异对物种的适应性演化和复杂性状形成具有重要影响。这些变异包括大片段DNA序列的插入、缺失、倒位和易位等,可以改变基因的编码序列和数量,同时影响调控元件如启动子和增强子的功能。目前已知禽类定位的经济性状原因突变以结构变异形式为主,因此精准快的结构变异分型技术在家禽育种生产工作具有巨大的应用前景。但当前单个结构变异检测主要依赖于聚合酶链式反应(PCR)结合琼脂糖凝胶电泳,其在生产现场的应用受到限制。CRISPR/Cas系统结合恒温扩增(LAMP)具有温度恒定、反应迅速、便携性强等特点,该系统提供了一种高特异性和可视化核酸检测手段,更适用于野外或现场环境。因此,本研究以LAMP联合CRISPR/Cas12a技术为基础建立一种新型禽类结构变异检测方法:一是通过LAMP技术于恒温条件下迅速扩增目标核酸,二是利用CRISPR/Cas12a技术特异性识别LAMP产物中的目标序列,三是在Cas12a被激活后对F-Q探针进行切割以输出荧光,实现检测结果的可视化。最后,通过扩增曲线和荧光信号辨别检测结果,并与普通PCR检测结果进行一致性检验,评估该检测方法的灵敏性和特异度。本研究通过以鸭白羽性状MITF基因、鸭生长性状IGF2BP1基因、鸡绿壳蛋性状SLCO1B3基因及鸡生长性状IGF2BP1基因原因突变(均为结构变异)为研究对象,构建LAMP-CRISPR/Cas结构变异检测方法,随后以普通PCR为标准进行检测方法准确性评估。具体研究结果如下:1)利用引物设计网站成功设计针对以上四个基因的LAMP引物,完成了目的基因的扩增,并成功建立LAMP的可视化反应;2)成功设计并构建了针对目的基因的cr RNA;3)成功建立了LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法;4)以PCR为标准的LAMP可视化反应检测各基因结构变异的一致率分别为:鸭MITF基因D等位基因83%、I等位基因87%,鸭IGF2BP1基因D等位基因83%、I等位基因89%,鸡SLCO1B3基因W等位基因81%,鸡IGF2BP1基因W等位基因93%、L2等位基因88%;5)以PCR为标准LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法对各基因结构变异敏感度和特异性均为100%,一致率分别为:鸭MITF基因D等位基因和I等位基因均为92%;鸭IGF2BP1基因D等位基因87%、I等位基因92%,鸡SLCO1B3基因W等位基因91%;鸡IGF2BP1基因W等位基因96%、L2等位基因93%;综上所述,本研究基于LAMP恒温扩增技术和CRISPR/Cas12a技术成功建立了同时满足现场可视分析和高特异性的禽类结构变异检测方法,该方法在45min内便可通过蓝光照射肉眼观察到结果,具有良好的灵敏性和特异性,且操作简便、无需昂贵设备,为实现现场、快速、特异的禽类结构变异可视化分析提供了切实可行的技术支持,具有广泛的应用前景。

关键词： LAMP CRISPR/Cas12a 基因组结构变异检测方法

基于噬菌体展示技术筛选和鉴定人源性HPV18VLP中和抗体

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基于噬菌体展示技术筛选和鉴定人源性HPV18VLP中和抗体

作者：顾亚茹重庆理工大学

学位级别：硕士

[目的]构建人源性Fab噬菌体抗体库,筛选出与HPV18VLP特异性结合的人源性Fab抗体,为HPV18中和抗体研发及基于抗原抗体复合物结构学指导的HPV疫苗设计提供参考。[方法]1.从接种人乳头瘤病毒（HPV）疫苗的15名女性的外周血中分离出外周血... 详细信息

[目的]构建人源性Fab噬菌体抗体库,筛选出与HPV18VLP特异性结合的人源性Fab抗体,为HPV18中和抗体研发及基于抗原抗体复合物结构学指导的HPV疫苗设计提供参考。[方法]1.从接种人乳头瘤病毒（HPV）疫苗的15名女性的外周血中分离出外周血单个核细胞（PBMC）,并从中提取总RNA,进行反转录以制备c DNA。以此c DNA为模板分别扩增抗体重链和轻链的可变区序列,并以p Comb3XTT和p Comb3XLambda噬菌体质粒为模板,扩增抗体重链和轻链的恒定区。2.通过重叠延伸PCR技术,将抗体重链的可变区与恒定区连接,同时将轻链的可变区与恒定区连接,形成了Fd重链和λ/κ轻链。再以Fd重链和λ/κ轻链作为模板,进行进一步的重叠延伸PCR,最终获得完整的Fab基因片段。将Fab片段连接至p Comb3XTT噬菌体质粒中,通过电转化的方式将其导入大肠杆菌XL1-Blue并以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,以构建人源性Fab噬菌体抗体库。3.以纯化的HPV18VLP作为抗原进行亲和筛选,通过四轮筛选,富集特异性结合HPV18VLP的噬菌体抗体。采用Phage-ELEIA法对第三轮和第四轮筛选后的噬菌体抗体进行鉴定,并对获得的阳性克隆进行可溶性表达。利用Western-Blot和免疫组化技术鉴定获得的VLP18-Fab抗体的特异性,采用BLI技术评估该VLP18-Fab抗体的亲和力,并通过人乳头瘤病毒假病毒中和实验验证该VLP18-Fab抗体的中和活性。4.使用人工智能结构解析工具Alphafold2对VLP18-Fab抗体及HPV18VLP重组抗原的三维结构进行预测,并利用Discovery Studio模拟了抗体与抗原结合复合物的结构,以及锚定抗体与抗原结合的潜在表位。[结果]1.成功构建了库容量为4.91×10～9的Fabλ噬菌体抗体库和库容量为2.92×10～9的Fabκ噬菌体抗体库,通过PCR鉴定和酶切鉴定,阳性率均达到了100%。基因序列分析,Fabλ和Fabκ噬菌体库的同源性分别66.84%和56.65%。2.用纯化的HPV18VLP作为抗原,Fabλ噬菌体抗体库四轮筛选后,同源性增加为80.82%;Fabκ噬菌体抗体库四轮筛选后,同源性增加为82.22%。将Fabλ噬菌体抗库中序列一致且阳性值最高的单克隆转入大肠杆菌HB2151进行周质空间表达,SDS-PAGE电泳检测表明VLP18-Fab抗体成功表达,且分子量约为42 k Da。***-Blot、免疫组化鉴定结果显示VLP18-Fab抗体可以特异性结合HPV18VLP抗原,BLI结果显示出微摩尔级亲和力(KD值为1.002×10 M),假病毒中和实验显示VLP18-Fab抗体组与对照组相比,中和活性显著增强（P<0.0001）。4.将Alphafold2预测的VLP18-Fab抗体与HPV18VLP抗原PLDD评分值最高的三维结构,用Discovery Studio预测抗体与抗原的结合表位结果显示VLP18-Fab抗体与抗原上Ser、Ile、Phe、Tyr、His、Phe、Gly、Leu、Pro、Asp、Asn、Ser、Ile、Glu、Lys、Phe、Ser 、Leu、Asp、Leu、Asp、Gln、Asp、Leu、Leu、Arg、Thr、Ile、Arg、Lys、Arg、Ser氨基酸序列结合。[结论]成功构建人源特异性Fab噬菌体抗体库,并从中筛选到1株与HPV18VLP特异性结合的Fab抗体,该抗体还表现出强大的中和活性。此外,利用Discovery Studio对抗体与抗原的结合表位进行了模拟。总体而言,研究结果强调了噬菌体展示的抗体库技术筛选中和抗体的潜力,并为HPV疫苗的设计提供了指导意义。

关键词：噬菌体展示技术宫颈癌中和抗体分子对接

对外汉语初级综合课寓言故事教学设计研究 ——以泰国芭堤雅明满学校六年级中文课堂为例

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对外汉语初级综合课寓言故事教学设计研究 ——以泰国芭堤雅明满...

作者：韩青茹浙江科技大学

学位级别：硕士

寓言是对外汉语教学的一项重要内容,具有语言和文化的双重教育意义,学习寓言不仅可以扩大学生的汉语词汇量,提高汉语交际与书面表达的能力,更能够帮助学生从中更好地了解和学习相关的文化知识。本文以寓言故事作为研究对象,将研究范围... 详细信息

寓言是对外汉语教学的一项重要内容,具有语言和文化的双重教育意义,学习寓言不仅可以扩大学生的汉语词汇量,提高汉语交际与书面表达的能力,更能够帮助学生从中更好地了解和学习相关的文化知识。本文以寓言故事作为研究对象,将研究范围锁定在《汉语》教材第六册中涉及到的寓言课文,从寓言的特点入手,明确寓言在对外汉语教学中特有的教学意义,并以相关的资料分析为基础,对该校六年级中文课及中文课堂中寓言课文教学情况作出调查与分析,设计对外汉语初级阶段寓言故事教学方案,之后根据教师和学生的反馈以及教师的课堂实践作出反思,并且对相应的问题提出建议。本文主要分为六部分:第一部分为引言,主要阐述了本选题的缘由、意义,分析了国内外关于寓言教学的研究现状,提出本文的研究方法。第二部分为寓言与其对外初级汉语教学的意义,笔者从寓言的定义、特点等基本理论的介绍入手,阐述了寓言在对外初级汉语教学中的教学和教育价值。第三部分为对寓言教学情况的教学现状调查及分析。主要对该校“中文课”上寓言课文教学现状从学生汉语学习情况、“中文课”学习现状和寓言课文教学相关情况三方面进行调查及分析,得出三点内容:一是学生普遍对于以寓言题材改编的课文更感兴趣,尤其是其中的故事情节和人物角色;二是学生希望教师在寓言课堂上能够组织丰富的教学活动;三是学生普遍对寓言故事蕴含的寓意难以理解,并且学习程度一般。第四部分为寓言课文教学设计。根据教学对象、使用教材、教学原则等方面的分析,并依据第三部分调查得来的结果作出针对性的寓言教学设计,分为激发学生兴趣点的课堂导入设计、组织丰富课堂活动的课文学习设计和加深文化理解的寓意学习设计三方面的教学设计;第五部分为具体的教学设计案例,对《刻舟求剑》和《乌鸦喝水》两篇寓言故事分别进行教学设计;第六部分为教学设计反思,根据教师及学生反馈分析本教学设计的优点及不足,并针对教学设计的不足给出相应的解决对策。

关键词：寓言寓言故事泰国对外汉语综合课教学设计

群体感应分子在啤酒酵母S2乙醇耐受中的作用及机制

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群体感应分子在啤酒酵母S2乙醇耐受中的作用及机制

作者：潘玉茹河南科技学院

学位级别：硕士

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基于核心素养的高中化学大单元教学研究

基于核心素养的高中化学大单元教学研究

作者：叶文茹伊犁师范大学

学位级别：硕士

具有恶化效应和学习效应的单机双代理调度问题研究

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具有恶化效应和学习效应的单机双代理调度问题研究

作者：杨新茹沈阳大学

学位级别：硕士

多代理调度是物流生产调度的重要组成部分,本文考虑的问题是多代理调度问题中的单机双代理调度问题。单机多代理调度问题即不同的代理商对应不同的客户需求,这些代理商在一台机器上竞争有限的资源,使得各自的目标值得到满足。在单机双... 详细信息

多代理调度是物流生产调度的重要组成部分,本文考虑的问题是多代理调度问题中的单机双代理调度问题。单机多代理调度问题即不同的代理商对应不同的客户需求,这些代理商在一台机器上竞争有限的资源,使得各自的目标值得到满足。在单机双代理调度问题中,需要设计一个调度方案,以确保在单机环境下,满足一个代理商特定约束条件的同时,实现另一代理商的目标值的最优化。具体而言,这一方案需要确保其中一个代理商的目标值不超过给定的上界,而另一个代理商的目标值则达到最优。本文从钢铁企业的热轧实际生产流程中,提炼出一类工件随加工位置呈一般线性恶化或一般线性学习效应规律,且工件正常加工时长为单位时间的单机双代理调度问题。在该问题中,热轧阶段进入冷轧厂进行冷轧的工件看作A代理,直接销售给顾客的工件看作B代理,寻求一种调度方案在满足A代理商目标值最大完工时间不大于给定上界的约束条件下,以优化B代理商的目标值最小化总加权延误工件数量。在现有的单机双代理调度问题研究中,有将A代理商目标值为最大完工时间,B代理商目标值为加权总误工数的条件结合在一起研究的,但很少有在此基础上加上恶化效应和学习效应的约束条件,文本将以上约束条件结合在一起进行研究。本文针对文中的两个调度问题设计了动态规划算法,并且为了求解B代理商目标函数最优值的上下界,设计了两个时间复杂度各异的算法。在此基础上,结合这些算法,进一步构建了一个完全多项式时间近似方案,使本文研究的单机双代理调度问题在多项式时间内可解。

关键词：单机双代理调度最大完工时间总加权延误工件恶化效应完全多项式时间近似方案

单细胞转录组测序技术及其在免疫学研究中的应用

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海军军医大学学报 2024年第2期45卷 145-154页

作者：朱玉茹晨李宇王越海军军医大学(第二军医大学)基础医学院上海200433 海军军医大学(第二军医大学)转化医学研究中心干细胞与再生医学研究室上海200433 上海市细胞工程重点实验室上海200433

免疫系统具有复杂性、多变性以及可塑性,目前其组成和动态变化的研究只局限在群体效应,无法体现其异质性。单细胞技术的出现革新了研究者们对免疫学问题的认识。单细胞RNA测序技术是目前应用最广泛的单细胞技术,它能够在单细胞和单分子... 详细信息

免疫系统具有复杂性、多变性以及可塑性,目前其组成和动态变化的研究只局限在群体效应,无法体现其异质性。单细胞技术的出现革新了研究者们对免疫学问题的认识。单细胞RNA测序技术是目前应用最广泛的单细胞技术,它能够在单细胞和单分子的水平进行免疫学分析,揭示生理或病理条件下的免疫反应过程。本文对单细胞RNA测序技术的一般流程、发展及其在免疫学方面的应用进展进行综述,并展望其在免疫学方面的发展前景。

关键词：免疫系统单细胞测序 RNA测序免疫反应

维普期刊数据库

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欠驱动机械手结构设计与控制技术研究

欠驱动机械手结构设计与控制技术研究

作者：茹琛太原科技大学

学位级别：硕士

随着工业朝着精密化、智能化的方向发展,各行各业对机器人的抓取能力提出了更高的要求。末端执行器是机器人与工件直接接触的重要组成部分,在整个加工、生产和运输中都发挥着重要作用。传统的末端执行器只能完成对特定物体的抓取,具有... 详细信息

随着工业朝着精密化、智能化的方向发展,各行各业对机器人的抓取能力提出了更高的要求。末端执行器是机器人与工件直接接触的重要组成部分,在整个加工、生产和运输中都发挥着重要作用。传统的末端执行器只能完成对特定物体的抓取,具有一定的局限性,为满足机器人的多样化操作需求,迫切需要一种能够实现智能抓取、柔性装配和快速更换的智能灵巧型末端执行器。欠驱动机械手作为机器人末端执行器的一种,具有单输入多输出的特点,一直是国内外学者的热点研究课题,但多数欠驱动机械手的手掌为固定平面且末端轨迹为圆弧,抓取稳定性较差,影响整体生产效率。针对以上问题,本文设计了一种新型欠驱动机械手,主要研究内容如下:首先以欠驱动原理为理论依据,结合直线运动机构,设计出一种具有精确平行捏取、平行抓取及自适应包络抓取三种抓取模式的机械手。通过对该机械手手指、手掌和传动定位结构的设计,提高了在不同工况下的适应能力,能够完成对不同尺寸和形状物体的抓取。其次,使用D-H法建立了机械手的连杆坐标系,完成了运动学分析并对机械手的不同抓取模式进行静力学分析。以抓取圆柱型物体为例,以杆长为设计变量,以接触力大于零为约束条件,以接触力均匀性为优化目标,使用遗传算法确定手指结构尺寸参数,并在此基础上选定机械手材料,使用Solid Works和ADAMS进行抓取仿真分析,证明了结构设计和力学分析的合理性。然后,在Matlab中的机器人工具箱建立了机械手模型,并使用蒙特卡洛法确定手指的可达工作空间。基于软手指点接触模型分析机械手的最大抓取质量与抓取目标质心位置、摩擦系数和接触点之间的关系。根据机械手抓取过程中的弹射现象,确定了影响抓取稳定性的主要因素。最后,根据接触力信号反馈的控制方式对机械手的控制系统进行设计,基于Py Qt库对上位机交互页面进行搭建,实现与机械手的智能交互。对机械手系统的关键部件进行了选型及相应的I/O分配,包括微处理器、电源模块、传感器模块、电机驱动模块等。

关键词：欠驱动机械手直线运动机构精确平行捏取自适应性优化设计

基于人工智能的低体温症死亡风险预警技术研究

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基于人工智能的低体温症死亡风险预警技术研究

作者：茹国锋天津理工大学

学位级别：硕士