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鸡毒支原体 Taq Man实时荧光定量PCR检测方法的建立

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动物医学进展 2024年第4期45卷 64-68页

作者：孙宇苗立中程立坤赵家磊赵修报沈志强王敬茹李书光余燕山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 河南科技学院动物科技学院河南新乡453003 山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 滨城区畜牧兽医服务中心山东滨州256600

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和Taq Man探针,建立鸡毒支原体Taq Man实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit,CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准... 详细信息

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和Taq Man探针,建立鸡毒支原体Taq Man实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit,CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R^(2)=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体Taq Man探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。

关键词：鸡毒支原体 Taq Man探针荧光定量PCR

鸭瘟病毒Cycleave荧光PCR检测方法的建立

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中国动物传染病学报 2023年

作者：于新友李天芝苗立中山东省滨州畜牧兽医研究院山东绿都生物科技有限公司

建立敏感、快速和特异的鸭瘟病毒（DPV）检测方法。根据NCBI收录的DPVUL6基因序列，设计了1对特异性引物和1条cycling探针，通过优化反应条件，建立了检测DPV的Cycleave荧光PCR检测方法，结果显示，该方法特异性高，不与其他常见鸭病病... 详细信息

建立敏感、快速和特异的鸭瘟病毒（DPV）检测方法。根据NCBI收录的DPVUL6基因序列，设计了1对特异性引物和1条cycling探针，通过优化反应条件，建立了检测DPV的Cycleave荧光PCR检测方法，结果显示，该方法特异性高，不与其他常见鸭病病原体发生交叉反应，检测DPV灵敏度可达6.5拷贝/μL，批内与批间的变异系数均小于2%。研究表明：建立的DPV Cycleave荧光定量PCR 方法特异性高、重复性好、敏感性高，可用于检测临床样品，为鸭瘟的诊断和防控奠定了基础。

关键词：鸭瘟病毒 Cycleave荧光PCR 检测 cycling探针

鸭甲肝病毒1型和3型一步法双重RT-PCR鉴别检测方法的建立及其初步应用

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中国兽医学报 2023年第1期43卷 55-60页

作者：祖立闯李娇苗立中郭璐王艳萍王文秀山东省淄博市动物疫病预防与控制中心山东淄博255000 山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 山东省院士工作站山东滨州256600

为建立一种快速鉴别不同基因型鸭甲肝病毒(DHAV)的检测方法,根据DHAV-1和DHAV-3特异性序列,分别设计合成鉴别检测引物,经一步法双重RT-PCR反应条件的优化,建立了鉴别DHAV-1和DHAV-3的一步法双重RT-PCR方法,并应用该方法对2016—2021年... 详细信息

为建立一种快速鉴别不同基因型鸭甲肝病毒(DHAV)的检测方法,根据DHAV-1和DHAV-3特异性序列,分别设计合成鉴别检测引物,经一步法双重RT-PCR反应条件的优化,建立了鉴别DHAV-1和DHAV-3的一步法双重RT-PCR方法,并应用该方法对2016—2021年山东地区采集的58份临床病料样品进行病原学检测分析。结果显示:该方法能够分别扩增出DHAV-1的230 bp和DHAV-3的502 bp的特异性条带,而DTMUV、NDV、AIV-H9、FADV、DEV、GPV均无任何扩增条带。该方法最低可检测到0.62 ng DHAV-1 RNA和0.59 ng DHAV-3 RNA。该方法与病毒分离方法的符合率达100%。该方法检测58份临床病料样品,共检测出阳性样品27份,阳性率达46.55%,其中2016—2021年DHAV-1阳性率分别为33.33%,25.00%,22.22%,12.50%,11.11%,0.00%;DHAV-3阳性率分别为8.33%,16.67%,22.22%,37.50%,33.33%,37.50%。表明建立的DHAV-1和DHAV-3一步法双重RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、准确性和临床适用性;同时发现山东地区DAHV的优势流行毒株已由DHAV-1转变为DHAV-3。

关键词：鸭甲肝病毒一步RT-PCR 鉴别检测方法病原学流行毒株

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C型副鸡禽杆菌山东株的分离及PCR鉴定

家禽科学 2023年第10期45卷 26-30,I0010页

作者：吴忆春苗立中滨州职业学院生物工程学院山东滨州256603 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

山东某免疫鸡传染性鼻炎(A型)灭活疫苗的蛋鸡场,在疫苗保护期内发生疑似鸡传染性鼻炎感染。通过对患病鸡进行剖检、细菌分离、PCR鉴定和血清型鉴定,结合HMTp210基因Region 2序列测序并分析,最终确定引起该蛋鸡场发病的病原是C型副鸡禽... 详细信息

山东某免疫鸡传染性鼻炎(A型)灭活疫苗的蛋鸡场,在疫苗保护期内发生疑似鸡传染性鼻炎感染。通过对患病鸡进行剖检、细菌分离、PCR鉴定和血清型鉴定,结合HMTp210基因Region 2序列测序并分析,最终确定引起该蛋鸡场发病的病原是C型副鸡禽杆菌。

关键词：鸡传染性鼻炎 C型副鸡禽杆菌分离鉴定基因测序

副猪嗜血杆菌荧光定量PCR方法建立及其分离株高密度发酵研究

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副猪嗜血杆菌荧光定量PCR方法建立及其分离株高密度发酵研究

作者：苗立中吉林大学

学位级别：硕士

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)感染引起的疾病，又被称为猪革拉泽氏病。近年来随着世界规模化养猪业的发展，该病已成为严重影响养猪业的新发细菌病之一，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。本研究分离鉴... 详细信息

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)感染引起的疾病，又被称为猪革拉泽氏病。近年来随着世界规模化养猪业的发展，该病已成为严重影响养猪业的新发细菌病之一，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。本研究分离鉴定2株副猪嗜血杆菌;建立了副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法并应用于临床;优了化副猪嗜血杆菌大规模高密度发酵工艺并应用于生产。为我国的副猪嗜血杆菌病的临床诊断、病原检测、疫苗抗原生产打下基础，其主要研究内容如下。 1.疑似副猪嗜血杆菌分离培养及鉴定从浙江和河南疑似副猪嗜血杆菌病猪的病变组织中分离到2株细菌，对其进行形态观察、生化特性等常规性鉴定，同时进行了PCR鉴定(根据HPS16S rRNA基因设计的特异性引物)，并将扩增片段测序，测序结果与已知副猪嗜血杆菌的16S rRNA基因序列进行比对分析。生化试验结果为蔗糖、接触酶、半乳糖和果糖等阳性，D-甘露醇、H2S、氧化酶和D-山梨醇阴性，生长需要NAD。浙江株和新乡株16S rRNA序列与已发表的副猪嗜血杆菌16S rRNA序列同源性最高分别为100%和99%，因此鉴定该分离菌株为副猪嗜血杆菌。 2.副猪嗜血杆菌实荧光定量PCR方法建立及应用建立了基于SYBR Green I的快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的实时荧光定量PCR方法。参照GenBank公布的HPS的infB基因序列(DQ:781933.1)，设计特异性引物;提取HPS基因组，进行PCR扩增，回收目的片段;构建阳性标准模板，建立标准曲线;验证其敏感性、重复性和特异性。结果显示，本试验得到了阳性标准质粒，并建立了标准曲线，其线性关系良好，在100copies/μL检测范围内;该方法敏感性达到10copies/μL，比常规PCR高100倍，重复性试验变异系数均小于2.5%，同时对HPS具有良好的特异性。结果表明，本研究所建立的副猪嗜血杆菌SYBR GreenⅠReal-time PCR检测方法可用于临床对HPS的快速诊断和定量检测。 3.副猪嗜血杆菌分离菌株大规模高密度发酵培养工艺优化及应用以副猪嗜血杆菌浙江分离株ZJ-1株为研究对象，通过单因素试验和正交试验进行副猪嗜血杆菌液体培养基配方的优化，单因素试验结果表明：选用蔗糖作为副猪嗜血杆菌培养的初始碳源，初始蔗糖浓度应为5g/L;蛋白胨、酵母粉、胰酪胨及大豆胨在副猪嗜血杆菌发酵培养基中的最佳添加量分别为4g/L、2g/L、4g/L及3g/L;在副猪嗜血杆菌培养基中应添加2g/L的硫酸铵;向副猪嗜血杆菌培养基中添加5%的马血清时，菌体浓度及活菌数目最高，分别为0.671、1.8x108cfu/ml;选取辅酶的添加浓度为0.005%;正交试验实验结果表明：当选取蔗糖2g/L;酵母粉2g/L;硫酸铵2g/L;马血清5%时菌体密度及活菌数目最高。高密度发酵条件优化结果：温度为37℃、溶氧水平维持在10%、培养基pH值为7.2、补料方式为恒葡萄糖浓度时ZJ-1株菌体密度及活菌数目达到最高，分别为16.8、3.6x10cfu/ml。利用优化配方和优化发酵工艺，在GMP生产车间大规模试生产3批次副猪嗜血杆菌半成品抗原，效果良好。因此本研究为大批量高密度发酵生产副猪嗜血杆菌抗原提供了试验依据。

关键词：副猪嗜血杆菌荧光定量PCR 分离鉴定高密度发酵

CRISPR-Cas12a在病原检测中的应用进展

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山东畜牧兽医 2023年第9期44卷 90-94页

作者：王亮宋毅苗立中撒瑞雪常维山山东省淄博市博山区农业农村局山东淄博255000 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州山东农业大学动物科技学院山东泰安

发病早期对病原体的快速诊断对疾病的预防和控制具有重要意义。成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPRs)和相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成的CRISPR-Cas系统是强大的基因编辑工具,其中的CRISPR-Cas12a系统在病原体的快速诊断... 详细信息

发病早期对病原体的快速诊断对疾病的预防和控制具有重要意义。成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPRs)和相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成的CRISPR-Cas系统是强大的基因编辑工具,其中的CRISPR-Cas12a系统在病原体的快速诊断方面展现出了巨大的潜力,其与核酸扩增、荧光标记等技术结合建立的检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测方便等特点,适合现场即时检测。本文回顾了CRISPR-Cas系统的作用机制,总结了近年来CRISPR-Cas12a在病原菌检测中的研究进展,提出了面临的挑战和展望,以期为病原体检测技术的开发和疫病防控提供参考。

关键词： CRISPR-Cas12a 病原检测分子诊断

鸭甲型肝炎病毒3型和鸭圆环病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

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中国家禽 2023年第12期45卷 47-52页

作者：于新友李天芝苗立中谢金文王文秀山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 山东省院士工作站山东滨州256600

为建立同时检测鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)和鸭圆环病毒(DuCV)的双重荧光定量PCR方法,试验根据NCBI中收录的DHAV-3 VP1和DuCV cap基因序列,分别设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测DHAV-3和DuCV的双重荧光定量PCR,对该... 详细信息

为建立同时检测鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)和鸭圆环病毒(DuCV)的双重荧光定量PCR方法,试验根据NCBI中收录的DHAV-3 VP1和DuCV cap基因序列,分别设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测DHAV-3和DuCV的双重荧光定量PCR,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估,并采用该方法对临床样品进行检测。结果显示:建立的方法不与其他常见鸭病原发生交叉反应,对DHAV-3和DuCV的检测灵敏度分别为3.8 copies/μL和7.3 copies/μL,批内和批间变异系数均小于2%,从65份临床样品中分别检出DHAV-3和DuCV阳性样品11份和28份,与现有地方标准符合率分别为95.4%和90.8%。研究表明,建立的双重荧光定量PCR特异性强、敏感性高、重复性好,可用于DHAV-3和DuCV的快速检测。

关键词：鸭甲型肝炎病毒3型鸭圆环病毒双重荧光定量PCR

PCV2感染对猪淋巴细胞NF-κB信号通路及炎性细胞因子表达的动态影响

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中国兽医学报 2022年第6期42卷 1115-1121页

作者：董林王艳萍唐娜徐倩倩苗立中王金良沈志强山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600

研究PCV2感染猪淋巴细胞对核因子NF-κB信号通路的影响,探索其在NF-κB信号通路中调控炎性细胞因子生成作用机制。选取10头28日龄PCV2抗原、抗体双阴性仔猪,无菌采集、分离脾淋巴细胞,制成单细胞悬液,分PCV2感染组和对照组进行体外培养... 详细信息

研究PCV2感染猪淋巴细胞对核因子NF-κB信号通路的影响,探索其在NF-κB信号通路中调控炎性细胞因子生成作用机制。选取10头28日龄PCV2抗原、抗体双阴性仔猪,无菌采集、分离脾淋巴细胞,制成单细胞悬液,分PCV2感染组和对照组进行体外培养。感染组PCV2病毒添加剂量250μL/100 mL细胞悬液,对照组加入同体积细胞培养液,培养后0,6,12,24,48 h收集淋巴细胞和上清液。共聚焦电镜检测NF-κB核移位,Western blot检测NF-κB/P65核蛋白、磷酸化抑制性κBα蛋白含量,EMSA检测NF-κB与DNA的结合率,ELISA试剂盒检测上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β1的含量。结果显示,NF-κB/P65蛋白在淋巴细胞核中移位程度随着PCV2感染时间增加而增强,6 h后试验组显著高于对照组(P0.05)。淋巴细胞质中p-IκBα蛋白表达在PCV2感染后24 h达到峰值,且在整个检测期间相对对照组差异极显著(P0.05),24 h有所升高,48 h感染组IL-1β和IL-6含量显著高于对照组(P<0.05)。IL-17和TNF-α随着PCV2感染时间延长含量不断增多,6 h显著高于对照组(P<0.05),24 h达到峰值,48 h极显著高于对照组(P<0.01)。IL-10含量呈现明显的先升高后降低的趋势,PCV2感染组6 h开始升高,12 h显著高于对照组(P<0.05),24 h开始降低,48 h与对照组基本一致。TGF-β1含量呈现先降低后升高的趋势,感染组6~12 h含量显著低于对照组(P<0.05),24~48 h明显升高。结果表明,PCV2通过磷酸化降解途径显著激活淋巴细胞中NF-κB信号通路,使其核移位和DNA结合率显著增强,调控炎性细胞因子的表达。通过IL-10和TGF-β1的升高或降低调控机体在感染早期表现免疫抑制,后期出现全身炎症反应的病理特征,并通过TNF-α和IL-17的高表达加重机体全身炎症反应综合征。

关键词： PCV2 淋巴细胞 NF-κB 信号通路细胞因子

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Ⅰ群禽腺病毒的分离检测方法与疫苗研究进展

中国家禽 2023年第10期45卷 76-83页

作者：龙海川张鹤平苗立中张文通于新友徐新蕊河北工程大学生命科学与食品工程学院河北邯郸056038 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600

Ⅰ群禽腺病毒感染主要引起禽包涵体肝炎、心包积液综合征等,具有传播速度快、传播范围广的特点,给我国禽养殖业带来了严重的经济损失。Ⅰ群禽腺病毒分为12种血清型,各血清型之间不仅能交叉感染,还能与其他禽类致病微生物发生混合感染而... 详细信息

Ⅰ群禽腺病毒感染主要引起禽包涵体肝炎、心包积液综合征等,具有传播速度快、传播范围广的特点,给我国禽养殖业带来了严重的经济损失。Ⅰ群禽腺病毒分为12种血清型,各血清型之间不仅能交叉感染,还能与其他禽类致病微生物发生混合感染而且各个血清型之间交叉保护很弱甚至没有,给Ⅰ群禽腺病毒病诊断和疫苗研发带来很多困难。文章对Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定、实验室检测以及疫苗研发最新进展进行综述,为Ⅰ群禽腺病毒检测方法和疫苗研发提出提供合理的建议。

关键词：禽腺病毒检测疫苗